整粒和半粒青稞种子DNA的提取及RAPD检测

郝豆豆，张勇群*，高玉花，雷 鸣，武俊喜，拉 多

(1. 西藏自治区人民政府驻成都办事处医院，四川 成都 610000；2. 西藏大学，西藏 拉萨 850000；3. 中国科学院地理科学与资源研究所，西藏 拉萨 850000)



整粒和半粒青稞种子DNA的提取及RAPD检测

郝豆豆1，张勇群1*，高玉花2，雷 鸣2，武俊喜3，拉 多2

(1. 西藏自治区人民政府驻成都办事处医院，四川 成都 610000；2. 西藏大学，西藏 拉萨 850000；3. 中国科学院地理科学与资源研究所，西藏 拉萨 850000)

【目的】从青稞种子中提取高质量的基因组DNA。【方法】以半粒无胚青稞种子和整粒青稞种子为材料，用6种不同的方法提取基因组DNA，用琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性，紫外分光光度计法检测DNA的浓度和纯度，并对提取的DNA进行了RAPD-PCR扩增检测，同时将剩下的半粒有胚青稞种子进行萌发实验。【结果】从半粒和整粒青稞种子中都可以提取到高质量的DNA，用提取的DNA作为RAPD-PCR扩增检测模板，得到的扩增产物条带清晰，多态性条带丰富，其质量满足RAPD分子标记的要求。【结论】高盐低pH法提取的DNA质量最好，是这6种方法中的最佳方法；半粒青稞有胚种子也能够正常生根发芽，可作为遗传实验的材料。

青稞种子；基因组DNA；RAPD-PCR扩增

【研究意义】青稞(HordeumvulgareL.var.nudumHook.f.)隶属于禾本科大麦属，是栽培大麦的变种。因其成熟时籽粒的内外稃与颖果分离，籽粒裸露，故又称之为裸大麦[1]。分子标记是研究青稞遗传和育种的重要手段，既可以研究青稞种质资源的遗传多样性，又可以对农艺性状进行辅助选择，其优点是针对性强、效率高、节省时间。要进行分子标记实验，首先必须提取出高质量的基因组DNA。一般经常以新鲜叶片为提取材料，此过程需要浸种催芽，幼苗培养，液氮研磨[2]或者是在野外农田采集需要对采集的叶片进行保存，过程都比较繁琐。以青稞种子为材料，可以随时提取DNA，节省了人力、物力、财力。【前人研究进展】青稞麦苗的药用价值在明清时早有记载，如《本草纲目》中记载：“麦苗，辛寒无毒。主治消酒，毒暴热，酒疽目黄。又解盅毒、煮汁滤服，解时疾狂热，退胸膈热，利小肠，作斋食，甚益颜色”[3]。青藏高原高寒缺氧，环境恶劣，青稞是青藏高原最具特色的高原农作物，它的生长表现出了极强的抗逆性，这与它所含的相关耐逆基因之间有重要的关系，经研究发现，青稞符合“三高两低”(高蛋白、高纤维、高维生素和低脂肪、低糖)的健康饮食标准， 由于其独特的营养结构和保健疗效，在青藏高原地区有很高的利用价值，目前成为极具开发利用价值的高原特色农作物之一[4]。【本研究切入点】在进行青稞的各种遗传突变实验中，会出现后代籽粒稀少的情况，若将其繁殖，出现苗小、坏死、不出苗的情况[5]，会影响后续的实验，所以本研究将青稞种子一分为二，一半用来提取DNA，另一半用作青稞种子萌发实验，这样一半用来基因型鉴定，一半用来表型鉴定[6]。【拟解决的关键问题】本研究用了6种方法提取青稞整粒和半粒种子基因组DNA，旨在寻找最佳的提取方法，同时将另一半青稞种子进行萌发实验，以期为青稞育种实验提供科学参考。

1 材料与方法

1.1 材料

青稞种子采自西藏拉萨农牧区，将干燥的种子保存于4 ℃。

1.2 试剂

主要试剂有：无水乙醇，氯仿，异戊醇，异丙醇，CTAB，PVP，DTT，Tris，EDTA，SDS，λ-marker，marker-D，核苷酸染料，loading buffer，Agarose M，Taq酶，BPB，dNTP，MgCl2，10×Taq酶配套缓冲液(均购自生工生物工程(上海)有限公司)。

1.3 仪器

主要仪器有：Eppendorf 5417R型高速冷冻离心机，超低温冰箱，水浴锅-CD3192型恒温控制器，研钵，1.5 mL离心管，不同量程的移液器及相应的枪头(购自上海生物公司)，核算蛋白测定仪(Eppendorf BioPhotometer plus)，WD-9413B凝胶成像分析仪(购自北京市六一仪器厂)，电泳槽(购自BIO-RAD公司)，PCR-T100(购自BIO-RAD公司)。

1.4 青稞种子萌发

选择饱满的青稞种子，将种子在1/2处用小刀切开，使胚完整，将有胚的半粒种种子和整粒种子在铺有两层滤纸的培养皿中培养，在培养皿中加入自来水(以浸透滤纸稍有剩余为宜[7])，于室温下培养，每天适时给培养皿中加水，避免培养皿中水分完全蒸干，观察种子生根发芽的情况。剩下的无胚的半粒青稞种子用来提取DNA。

1.5 DNA提取方法

1.5.1 传统CTAB法[8]将饱满的整粒和无胚的半粒种子，分别放入1.5 mL的离心管中，加入1 mL预热的提取液(0.015 mol/L EDTA(pH8.0)，0.075 mol/L Tris-HCl(pH8.0)，1.5 % CTAB，1 mol/L NaCl)，浸泡30 min，然后将种子与提取液一同置于研钵中磨碎，再转入离心管中，于65 ℃水浴保温30 min，每隔几分钟颠倒混匀，使得粉末与提取缓冲液充分接触；加入500 μl氯仿/异戊醇(24∶1)，震荡混匀，4 ℃ 12 000 r/min离心10 min，取上清，加入等体积的氯仿/异戊醇(24∶1)，重复离心，直至中间无白色物质。取上清，加2倍体积的无水乙醇，于-20 ℃静置30 min；取出于室温14 000 r/min离心17 min，倒掉上清，用70 %乙醇洗涤沉淀2次，室温干燥后溶于30 μl TE。-20 ℃下保存备用。

1.5.2 改良CTAB[9]将饱满的整粒和无胚的半粒种子，分别放入1.5 mL的离心管中，加入1 mL 65 ℃预热的提取缓冲液(0.1 mol/L Tris-HCl(pH8.0)，0.1 mol/L EDTA(pH8.0)，0.5 mol/L NaCl，2 % CTAB，3 % PVP，2 % DTT)，浸泡30 min，然后将种子转移到研钵中磨碎，再转入离心管中，65 ℃水浴30 min，不时颠倒混匀；稍冷却后，4 ℃离心，12 000 r/min，10 min；取上清，加等体积的氯仿/异戊醇(24∶1)，震荡混匀，12 000 r/min，4 ℃，10 min，抽提2次；取上清，加等体积的异丙醇(-20 ℃预冷)，轻轻颠倒混匀，-20 ℃静置30 min；14 000 r/min，4 ℃，离心30 min，沉淀用70 %乙醇洗2次，风干后溶于50 μl TE。-20 ℃下保存备用。

1.5.3 高盐低pH法 将饱满的整粒和无胚的半粒种子，分别放入1.5 mL的离心管中，加入1 mL 65 ℃预热的提取缓冲液(0.1 mol/L NaAc，3 %可溶性PVP，2 % DTT，0.025 mol/L EDTA(pH 8.0),1.5 % SDS)，浸泡30 min，然后将种子与提取液一同置于研钵中磨碎，再转入离心管中，于65 ℃水浴保温30 min，不时颠倒混匀；稍冷却后于4 ℃，10 000 r/min离心10 min，取上清液加2/3倍体积的2.5 mol/L(pH4.8)的NaAc溶液，冰浴15 min；10 000 r/min，4 ℃，10 min。取上清液加等体积的氯仿/异戊醇(24∶1)，震荡混匀后10 000 r/min，4 ℃离心10 min；取上清，加等体积的异丙醇(-20 ℃预冷)，轻轻颠倒混匀，-20 ℃静置30 min；14 000 r/min，4 ℃离心20 min，用70 %乙醇洗涤沉淀2次，风干后溶于30 μl TE。-20 ℃下保存备用。

1.5.4 改良SDS法 将饱满的整粒和无胚的半粒种子，分别放入1.5 mL的离心管中，加入1 mL冰上预冷提取液(0.05 mol/L Tris-HCl(pH8.0)，0.05 mol/L EDTA(pH8.0)，2 % DTT，3 %PVP)，浸泡30 min，然后将种子与提取液一同置于研钵中磨碎，再转入离心管中于冰上放置10 min，然后6000 r/min离心10 min；弃上清，沉淀加入1 mL 65 ℃预热的裂解缓冲液，混匀后65 ℃水浴30 min，不时轻轻颠倒；取出后稍冷却后，加入等体积的氯仿/异戊醇(24∶1)，震荡至出现乳浊状，于4 ℃ 10 000 r/min离心10 min，重复两次；取上清液，加入1/4体积乙醇和1/3倍体积5 mol/L NaAC(pH 4.8)，立即10000 r/min离心10 min；取上清，加入等体积-20 ℃预冷的异丙醇，-20 ℃静置30 min；14 000 r/min，4 ℃离心23 min；并用70 %乙醇洗涤沉淀两次，风干后溶于50 μl TE。-20 ℃下保存备用。

1.5.5 高盐CTAB法[10]将饱满的整粒和无胚的半粒种子，分别放入1.5 mL的离心管中，加入1 mL 65 ℃预热的提取缓冲液(2 % CTAB，4 % PVP，2 mol/L NaCl，0.025 mol/L EDTA(pH8.0)，0.1 mol/L Tris-HCl(pH8.0)，3 % DTT)浸泡30 min，然后将种子与提取液一同置于研钵中磨碎，再转入离心管中，于65 ℃水浴保温30 min，不时颠倒混匀；稍冷却后于4 ℃，12 000 r/min离心10 min，取上清，加等体积的氯仿/异戊醇(24∶1)，震荡混匀，10 000 r/min，4 ℃离心10 min，抽提2次；加入等体积-20 ℃预冷的异丙醇，-20 ℃静置30 min；14 000 r/min，4 ℃离心10 min；弃上清，并用70 %乙醇洗涤沉淀2次，风干后溶于50 μl TE。-20 ℃下保存备用。

1.5.6 Ezup柱式试剂盒法 基因组提取试剂盒购于生工生物工程(上海)有限公司。按照说明书进行操作。

1.6 DNA检测方法

1.6.1 紫外分光光度计法 取2 μl DNA提取液用TE稀释50倍，以100 μl TE作为空白对照，利用核酸蛋白测定仪测得DNA样品的浓度，以及在波长260和280 nm处的吸光值，通过其比率可以判断DNA的纯度及提取效果。

1.6.2 琼脂糖凝胶电泳 配制0.8 %的琼脂糖凝胶，用λDNA作为对照，取4 μl DNA原液与1 μl的核酸染料混合，点入凝胶点样孔，在TAE缓冲液中以110 V的电压电泳50 min，并用凝胶成像系统(北京六一仪器)进行拍照并保存。

1.6.3 PCR扩增 以提取的DNA为模板，配制25 μl的反应体系：ddH2O：15.8 μl，Buffer：2 μl，MgCl2：2 μl，dNTP：2 μl，引物为RAPD12(CAATCGCCGT)：1 μl，Taq酶：0.2 μl，模板DNA：40 ng/10 μl PCR体系。

PCR反应程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性1 min，36.9 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，共35个循环；最后72 ℃延伸10 min。将PCR扩增产物经1.5 %琼脂糖凝胶电泳(110 V、50 min)分离，在凝胶电泳成像仪上观察，并保存图像。

2 结果与分析

2.1 青稞种子萌发培养

对整粒青稞种子和有胚的半粒青稞种子进行萌发培养，如图1所示，整粒青稞种子和半粒青稞种子都生根发芽了，半粒青稞种子的根和芽的长度虽然比整粒种子的短，但是可以说明半粒有胚青稞种子基本能够满足青稞种子的生长需要，同时也可以作为遗传实验材料。

2.2 紫外分光光度计检测结果

由表1可知，传统CTAB法提取的DNA浓度和纯度最低；改良CTAB法比传统CTAB法的效果好，但A260/A280的值低于1.6，说明所提DNA中有蛋白质、多糖等，A260/A230的值小于2.0，有小分子物质的污染；高盐低pH法提取的DNA的A260/A280的值符合标准，说明蛋白质、多糖等去除比较干净，A260/A230的值略低于2.0，说明DNA中有小分子物质的残留；Ezup柱式试剂盒法提取的DNA的A260/A230的值大于2.0，说明没有小分子物质的污染，A260/A280的值大于2.0说明有DNA中有RNA，试剂盒法提取的DNA浓度较低；高盐CTAB法提取的DNA中也有蛋白质、多糖、小分子物质的污染，且DNA浓度低。

1～2：半粒有胚青稞种子；3～4：整粒青稞种子1-2:Half-grain embryo seeds;3-4:Whole-grain seeds图1 整粒和半粒青稞种子萌发情况Fig.1 Germination situation of whole-grain and half-grain Hordeum vulgare var.nudum seeds

方法Methods编号Number浓度(μg/mL)ConcentrationA260/280A260/230传统CTAB法TraditionalCTABmethod半粒1(Half-grain1)301.140.90整粒2(Whole-grain2)401.220.70改良CTAB法ImprovedCTABmethod半粒3(Half-grain3)1101.591.65整粒4(Whole-grain4)1251.501.60高盐低pH法HighsaltandlowpH半粒5(Half-grain5)3351.761.80整粒6(Whole-grain6)5151.781.74Ezup柱式试剂盒法Ezupkitmethod半粒7(Half-grain7)1802.312.20整粒8(Whole-grain8)2552.162.10改良SDS法ImprovedSDSmethod半粒9(Half-grain9)751.611.63整粒10(Whole-grain10)1051.581.20高盐CTAB法HighsaltCTABmethod半粒11(Half-grain11)1301.501.43整粒12(Whole-grain12)2101.781.65

整粒和半粒青稞种子用同一种方法提取的效果基本相同，半粒青稞种子的DNA浓度比整粒小；六种方法中高盐低pH法提取效果最好。

2.3 琼脂糖凝胶电泳结果

由图2可知，传统CTAB和改良SDS法的泳道上没有DNA条带，点样孔中有残留物质，结合表1，这2种方法提取的DNA的浓度很低，杂质多，少量的DNA被大量的杂质粘到点样孔中；改良CTAB法和Ezup柱式试剂盒法提取的DNA有明显的拖尾现象，DNA降解严重；高盐CTAB法提取的DNA条带明亮，但是略有降解，高盐CTAB法的点样孔中有残留物质，说明杂质较多；高盐低pH法提取的DNA条带最亮点样孔中也几乎没有杂质，说明这种方法效果最好；半粒种子提取的DNA的条带不如整粒种子提取的DNA的条带量，说明半粒种子提取的DNA的浓度低。

M：λDNA；1，2：传统CTAB法；3，4：改良CTAB法；5，6：高盐低pH法；7，8：Ezup柱式试剂盒法；9，10：改良SDS法；11，12：高盐CTAB法；1，3，5，7，9，11：半粒青稞种子；2，4，6，8，10，12：整粒青稞种子图2 6种方法提取的青稞整粒和半粒种子DNA的电泳图谱Fig.2 Electrophoretogram of DNA extracted by six methods from whole-grain and half grain Hordeum vulgare var.nudum seeds

2.4 RAPD-PCR扩增结果

由图3可知，传统CTAB法和改良SDS法提取的DNA没有PCR扩增产物，高盐CTAB法提取的半粒青稞种子DNA和改良CTAB法提取的整粒青稞种子DNA没有PCR扩增产物，高盐低pH法和Ezup柱式试剂盒法提取的DNA用于RAPD-PCR扩增条带清晰，多态性条带丰富，可用于RAPD分子标记。

3 讨 论

青稞种子中蛋白质含量为10.1 %，高于其它谷类作物，矿质元素和维生素高于其它谷类作物[11]，去除这些物质是提取青稞种子DNA的关键。提取过程中，先用提取液将种子浸泡30 min，然后转入研钵中研磨，这样既有利于青稞种子的研磨，而且研磨过程中缓冲液中的PVP可以防止种子种的酚类物质被氧化，进而阻止其于DNA发生不可逆的结合[12]，EDTA、SDS、CTAB等可以及时的和蛋白质、糖类物质等反应，进而保护DNA，最后有利于得到更纯净、完整的DNA，DNA在研磨过程中速度要快，减少其在空气中暴露的时间，防止DNA在空气中被氧化[13]。在提取过程中，用氯仿/异物醇等进行抽提时，吸取上清的过程中避免将中间的蛋白质杂质吸进。纯DNA样品的A260/A280的值应在1.7～1.9之间，如果比值大于1.9说明有RNA的污染，如果比值小于1.6说明有蛋白质、多糖、多酚等的污染[13]；A260/A230的值应大于2.0，如果小于2.0说明有小分子物质(盐类、氨基酸、核苷酸)的污染[14]。

M：Marker-D；1，2：高盐CTAB法；3，4：改良SDS法；5，6：Ezup柱式试剂盒法；7，8：高盐低pH法；9，10：改良CTAB法；11，12：传统CTAB法其中1，3，5，7，9，11：整粒青稞种子，2，4，6，8，10，12：半粒青稞种子图3 6种方法提取的DNA的RAPD-PCR扩增电泳图谱Fig.3 RAPD-PCR amplification electrophoretogram of DNA extracted by six methods

4 结 论

青稞种子胚位于种子的一端，将含有胚的一端进行种子萌发培养，半粒种子DNA的提取主要是含有胚乳的部分。6种方法中，传统CTAB法和改良SDS法提取的DNA电泳图谱中没有条带，RAPD-PCR扩增产物中也没有条带，说明这2种方法没有成功提取到青稞种子DNA；高盐CTAB法和改良CTAB法提取的DNA纯度较低，DNA所含杂质的量比较多，高盐CTAB法提取的半粒青稞种子DNA和改良CTAB法提取的整粒青稞种子DNA没有PCR扩增产物，可能和种子的选取和操作的过程有关系，种子不饱满、半粒种子切割时胚乳部分取样太少、操纵过程中的步骤疏漏都可能导致DNA提取效果，从而影响PCR反应；试剂盒法提取的DNA的A260/A280大于2.0，说明DNA中有RNA，A260/A230大于2.0，说明小分子物质去除干净，但是DNA浓度很低，试剂盒价格昂贵，所以这种方法不是最佳方法；高盐低pH法提取的DNA没有蛋白质和多糖等的污染，DNA浓度较大，成本低，这种方法提取的青稞整粒和半粒种子DNA样品的扩增产物基本是均匀一致的，所以高盐低pH法为6种方法中最佳提取方法。同时还可以得出：半粒种子可以用来提取基因组DNA，所提取的DNA满足PCR反应的要求，可以用PCR分析来分析青稞基因组的任何DNA序列[15]，半粒青稞有胚种子也能够正常生根发芽，可作为遗传实验的材料。

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(责任编辑 李 洁)

DNA Extraction and RAPD Detection of Half-grain and Whole-grainHordeumvulgarevar.nudum

HAO Dou-dou1, ZHANG Yong-qun1 *, GAO Yu-hua2, LEI Ming2, WU Jun-xi3, LHA-duo2

(1.Hospital of Chengdu Office of People’s Government of Tibetan Autonomous Region, Sichuan Chengdu 610000, China; 2.Tibet University, Tibet Lhasa 850000, China; 3.Institute of Geographical Sciences, Tibet Lhasa 850000, China)

【Objective】 The high-quality DNA could be extracted fromHordeumvulgarevar.nudum. 【Method】 The genomic DNA was extracted by six different methods from half-grain embryoless seeds and whole-grain seeds ofHordeumvulgarevar.nudum, UV Spectrophotometry and agarose gel electrophoresis were used to detect the concentration, purity and completeness of DNA. RAPD-PCR amplification was carried out on the extracted DNA.At the same time, the left half-grain embryo seeds were cultured for germination experiments. 【Result】High-quality DNA was able to be extracted from both half-grain and whole-grainHordeumvulgarevar.nudumseeds. The extracted DNAs were employed as the template for RAPD-PCR amplification detection,and the products of amplification have clear and rich polymorphism bands, the quality of extracted DNA could meet the requirement of RAPD molecular marker experiment. 【Conclusion】 High salt and low pH which could extract high quality DNA is the best method of six methods.In addition, the sprouting experiments indicated that the left half-embryo seed was able to sprout normally and can be used as material of genetic experiment.

Hordeumvulgarevar.nudumseed;Genomic DNA;RAPD-PCR amplification

1001-4829(2017)6-1257-05

10.16213/j.cnki.scjas.2017.6.003

2016-10-12

湖南师范大学蛋白质与发育生物学教育部重点实验室(2014年)开放课题“几种濒危藏药材的DNA条形码研究”(2015DF03)；西藏自治区科技厅自然科学基金项目“濒危藏药材的生物信息学研究”(2015ZR-13-5)

郝豆豆(1992-)，女，硕士在读，研究方向为植物学，Tel：15289095670，E-mail：31724478@qq.com，*为通讯作者：张勇群(1976-)，女，博士，副教授，从事藏药材基因与功能研究，E-mail：yongqunzhang@yahoo.com。

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