高效排阻液相色谱法分析大豆7S和11S球蛋白的分子质量和纯度

高雪丽 陈复生 张丽芬 郭兴凤 樊明涛

(河南工业大学粮油食品学院1，郑州 450001) (许昌学院食品学院2，许昌 461000) (西北农林科技大学食品学院3，杨凌 712100)

高效排阻液相色谱法分析大豆7S和11S球蛋白的分子质量和纯度

高雪丽1,2,3陈复生1张丽芬1郭兴凤1樊明涛3

(河南工业大学粮油食品学院1，郑州 450001) (许昌学院食品学院2，许昌 461000) (西北农林科技大学食品学院3，杨凌 712100)

本文采用SE-HPLC法定量分析大豆7S和11S球蛋白的分子质量和纯度。首先，对SE-HPLC的色谱条件进行优化，最佳的SE-HPLC色谱条件是：洗脱液(水/乙腈)70/30，洗脱液流速1.0 mL/min，进样量10 μL。其次，绘制分子质量分析的标准曲线，分子质量标准曲线方程为Log (M)=-0.222 1x+3.878 9，线性相关系数为R2=0.996 9。以10倍信噪比确定定量限，得到7S(y=299.59x+3.771 2，R2=0.979 2)和11S(y=197.08x+4.148 5，R2=0.986 1)纯度分析标准曲线方程。最后根据分子质量和纯度分析的标准曲线方程计算大豆7S和11S球蛋白的分子质量和纯度。将所提纯的7S和11S样品的分子质量与7S和11S标品特征峰分子质量进行比对，表明所提纯样品为7S和11S。本试验所制得7S和11S的纯度分别达到86.3%和92.0%。

高效排阻液相色谱 大豆7S和11S球蛋白 分子质量 纯度

大豆蛋白根据生理功能，可分为贮藏蛋白和生物活性蛋白两大类。贮藏蛋白约占蛋白质的75%左右，大豆7S球蛋白(β-伴大豆球蛋白，7S)和大豆11S球蛋白(11S)占大豆贮藏蛋白的80%多，它们与大豆制品的加工性质关系比较密切[1-4]。因此，为了研究大豆7S和11S球蛋白的性质及其在食品加工中的应用，需对其进行分离提纯。近年来，国内外有关大豆7S和11S球蛋白分离纯化的研究较多[5-15]。这些研究大多针对大豆7S和11S组分的得率、蛋白质含量，而对于最终样品的纯度、分子质量鉴定较少，或只采用SDS-PAGE电泳法进行鉴定。

蛋白质的定量鉴定方法很多，如SDS-PAGE电泳法、等电聚焦电泳法、N-末端氨基酸残基分析、高效液相法等。由于蛋白质数量多，性质相似者在所难免，一个条件下两个蛋白质不能分开的可能性是很大的，选用任何一种鉴定方法都不能完全确定蛋白质的纯度，必须同时采用2～3种不同的纯度鉴定法才能确定[16]。高效排阻液相色谱(size exclusion-high-performance liquid chromatography, SE-HPLC)是定性和定量分析贮藏蛋白的有效方法，通过对蛋白质进行SE-HPLC分析，可以定量蛋白质的分子质量分布及纯度，且检测灵敏度高、速度快[17-18]。其测定提取蛋白的原理是通过样品色谱柱中的固定相，把样品溶在流动相里，经过色谱柱，样品会在流动相与固定相之间徘徊，不同性质贮藏蛋白，在各相中停留的时间比例也不同，就造成速度不同，最后到达检测器的时间就不同，在显示器上的图形就会出峰，实现分离[19-21]。

本研究采用SE-HPLC法定量分析大豆7S和11S球蛋白的分子质量和纯度，对于大豆7S和11S球蛋白提取中的定量鉴定有参考价值。

1 材料与方法

1.1 试验材料

脱脂豆粉(TSF)，蛋白质质量分数54.2%：郑州同创益生食品有限公司；SDS：天津市光复精密化工；盐酸：洛阳市昊华公司；三氨基甲烷(Tris)：上海市山浦化工有限公司；甘氨酸(氨基乙酸)：天津市科密欧化学试剂有限公司；AP(过硫酸铵)：洛阳市化学试剂厂；15～600 Ku 蛋白标品(808541，色谱级)、大豆7S球蛋白标品(C5868，色谱级)、大豆11S球蛋白标品(G3171，色谱级)：Sigma公司；其他化学试剂(分析纯)：郑州新风化学试剂有限公司。

1.2 主要仪器

D-37520真空冷冻干燥机：德国Kendro公司；2300K全自动凯氏定氮仪：瑞典FOSS TECATOR公司；HMS-3C型精密酸度计：台州市新恩精密粮仪器有限公司；D-37520型高速冷冻离心机：德国Kendro公司；2300K全自动凯氏定氮仪：瑞典FOSS TECATOR公司； 1200高效液相色谱仪：安捷伦科技有限公司(中国)；SEC G4000SW高效排阻液相色谱柱：日本TSK公司。

1.3 试验方法

1.3.1 大豆7S和11S球蛋白的提取

大豆7S和11S球蛋白的提取方法参照文献[22]。

1.3.2 高效排阻液相色谱(SE-HPLC)法分析条件的优化

采用SE-HPLC，用 TSK SEC 4000 柱对标准蛋白进行分离。洗脱液为色谱纯乙腈和水(含0.05%三氟乙酸)(V/V)，采样时间为18 min。在214 nm的波长下进行蛋白质的检测。标准蛋白的分子质量(ku)为：核糖核酸酶A(13.7)、卵清蛋白(44.3)、醛缩酶(150)和甲状腺球蛋白(670)。每个样品平行测量3次。所有待测样溶液进行SE-HPLC分析前，需经过0.45 μm的PVDF过滤器过滤。

1.3.2.1 洗脱液(水/乙腈)比例的优化

开始采样后，控制流速1.0 mL/min，进样量15 μL，洗脱液水/乙腈分别为60/40、68/32、70/30、72/28和80/20进行试验。每个条件平行测量3次。采集数据，进行分析和对比，确定洗脱液(水/乙腈)的比例。

1.3.2.2 洗脱液流速的优化

开始采样后，将条件设置为：进样量15 μL，洗脱液(水/乙腈)70/30，流速分别为0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2 mL/min，进行试验。每个条件平行测量3次。采样分析，进行分析和对比，确定最佳流速。

1.3.2.3 进样量的优化

开始采样后，将条件设置为：流速1.0 mL/min，洗脱液(水/乙腈)70/30，进样量分别为10、15、20 μL，进行试验。每个条件平行测量3次。采样分析，进行分析和对比，确定最佳进样量。

1.3.3 SE-HPLC法定量分析大豆7S和11S球蛋白的分子质量

1.3.3.1 大豆7S和11S球蛋白分子质量分析标准曲线的绘制

取1.3.2中蛋白标准品，根据1.3.2的优化结果，设置SE-HPLC分离条件。采集分析，对SE-HPLC分离条件优化效果进行验证。并绘制标准蛋白分子质量对数与保留时间的线性拟合图。

1.3.3.2 大豆7S和11S球蛋白分子质量的分析

准确称取提纯后的7S和11S 20.0 mg(精确到0.1 mg)，置于50 mL容量瓶中，用色谱纯水溶解、定容，配制成质量浓度为400 μg/mL的待测样溶液。根据1.3.2的优化结果，设置SE-HPLC分离条件，采集分析。得到7S和11S的SE-HPLC色谱图，根据1.3.3.1中的标准曲线，对7S和11S的分子质量进行分析。

1.3.4 SE-HPLC法定量分析大豆7S和11S球蛋白的纯度

1.3.4.1 大豆7S和11S球蛋白标准工作溶液配制

7S和11S标准工作溶液：准确称取5.0 mg(精确到0.1 mg)标准品，置于不同的10 mL容量瓶中，用色谱纯水溶解、定容，配制成质量浓度为500μg/mL的标准工作溶液；准确移取0.04、0.1、0.2、0.4 mL 7S或11S标准工作溶液，分别加入0.96、0.9、0.8、0.6 mL色谱纯水，即得浓度分别为20、50、100、200 μg/mL的系列标准工作溶液。

1.3.4.2 大豆7S和11S球蛋白纯度分析标准曲线的绘制

取1.3.4.1中质量浓度分别为20、50、100、200、500 μg/mL的系列7S和11S标准工作溶液，根据1.3.2中的优化结果，设置SE-HPLC分离条件，采集分析。得到标准蛋白浓度与峰面积的线性拟合曲线方程。

1.3.4.3 大豆7S和11S球蛋白纯度的分析

准确称取提纯后的7S和11S 20.0 mg(精确到0.1 mg)，置于50 mL容量瓶中，用色谱纯水溶解、定容，配制成质量浓度为400 μg/mL的待测样溶液。根据1.3.2中的优化结果，设置SE-HPLC分离条件，采集分析。得到7S和11S的SE-HPLC色谱图，对色谱图中7S和11S峰面积进行积分，根据1.3.4.2中的标准曲线方程，对7S和11S的纯度进行定量。

1.3.5 统计分析

利用 GraphPad Prism 5和Origin 8.5软件作图，采用 SASV 8 分析系统对数据进行统计分析。

2 结果与讨论

2.1 SE-HPLC分析条件的优化

2.1.1 洗脱液(水/乙腈)比例的优化

水/乙腈分别为60/40、68/32、70/30、72/28、80/20的SE-HPLC色谱图见图1。

由图1a可知，当水/乙腈为60/40时，4种蛋白，核糖核酸酶A(13.7)、卵清蛋白(44.3)、醛缩酶(150)和甲状腺球蛋白(670)中，仅3种组分有明显的出峰。色谱峰从左向右依次为醛缩酶(150)、卵清蛋白(44.3)、核糖核酸酶A(13.7)。而分子质量较大的甲状腺球蛋白(670)虽有出峰趋势，但不明显。当水/乙腈为70/30时(图1c)，4种组分均获得了良好的分离效果。然而，当水/乙腈为72/28、80/20时(图1d、e)，分子质量较大的组分的出峰不明显。

图1 不同水/乙腈的SE-HPLC色谱图

因此可知，随着水/乙腈混合溶液中水分比例的增大，液相色谱对4种蛋白组分的分离效果也呈现先增加后降低的趋势。这是因为蛋白质是生物大分子，有亲水基团和疏水基团组成，具有一定的极性，水/乙腈不同，洗脱液极性不同，只有合适的洗脱液极性才有利于蛋白质在液相中的分离。当洗脱液水/乙腈为70/30时，分离效果较好，4种组分都出现在色谱图中，得到有效的分离，峰型也较好。因此在后续试验中选择洗脱液水/乙腈为70/30。

2.1.2 进样量的优化

进样量分别为10、15、20 μL的SE-HPLC色谱图见图2。随着进样量的逐渐增大，洗脱峰的响应值在逐渐增加。当进样量为10 μL时，得到SE-HPLC色谱图峰型较好，响应值也适中。当进样量继续增大到为15、20 μL时，得到SE-HPLC色谱图反而峰型不好，峰的分离度也受到一定的影响，另外，进样量大也对标品造成浪费，增加试验的成本。响应值太低影响峰的观察，也难以区分样品峰和含有微量杂质的杂质峰。因此本试验确定的最佳进样量为10 μL。

图2 不同进样量的SE-HPLC色谱图

2.1.3 洗脱液流速的优化

图3是洗脱液流速分别为0.8、0.9、1.0、1.1、1.2 mL/min的SE-HPLC色谱图。由图3可知，随着洗脱液流速的逐渐增大，洗脱峰出来的时间在逐渐缩短。洗脱液流速过小，峰的保留时间就大，增加检测时间。洗脱液流速过大，峰的保留时间就小，影响峰的分离效果。本试验所选的几个洗脱液流速对峰型的影响不大。随着洗脱液流速的逐渐增大，离纵轴最近的峰的峰型也有微量的变化。综合分析，选取洗脱液流速为1.0 mL/min。

图3 不同洗脱液流速的SE-HPLC色谱图

因此，最佳的SE-HPLC色谱条件为：洗脱液(水/乙腈)70/30，洗脱液流速1.0 mL/min，进样量为10 μL。

2.1.4 验证试验

按照上述最佳SE-HPLC色谱条件进行采样。标准蛋白的SE-HPLC色谱图见图4。

图4 最优条件下的SE-HPLC色谱图

由图4可以看出，在优化的SE-HPLC色谱条件下，标品得到很好的分离，峰型较好，采样时间适中，重复试验表明该条件下进样得到的SE-HPLC色谱图重复性很好。可以在此优化条件下对样品进行分子质量及纯度的鉴定。

2.2 SE-HPLC法定量分析大豆7S和11S球蛋白的分子质量

2.2.1 分析大豆7S和11S球蛋白分子质量的标准曲线方程

根据图4最优条件下的SE-HPLC色谱图中标准蛋白的保留时间，绘制标准蛋白分子质量对数与出峰保留时间做线性拟合图，得到标准蛋白分子质量对数与出峰保留时间的线性拟和方程Log (M)=-0.222 1x+3.878 9，相关系数为R2=0.996 9。

2.2.2 大豆7S和11S球蛋白分子质量分析

在以上试验得到的最佳SE-HPLC色谱条件下，对7S和11S标品及提纯样品进行采样。得到7S和11S标品及提纯样品的SE-HPLC色谱图，结果见图5。由图5a可以看出，11S标品出现2个峰，7S标品出现1个峰，从出峰个数上可以看出7S标品的纯度较高一些，这与标品说明书介绍的纯度相一致。7S和11S是大豆蛋白的2个主要组分。11S的酸性亚基和一个基础的肽通过二硫键连接在一起，11S的分子质量约为360 000 Ku，约占大豆蛋白总量25%～35%，由6个不同的亚单位(多肽)组成的非糖蛋白，每个亚单位分别由1个酸性亚基和1个碱性亚基B通过二硫键连接而成。7S的分子质量约为180 000 Ku，由 α、α’ 和 β亚基组成，约占大豆蛋白30%～35%[4, 14]。将7S和11S标品的SE-HPLC色谱图中出峰的保留时间代入蛋白分子质量对数及出峰的保留时间的线性拟合方程，Log (M)=-0.222 1x+3.878 9，得到7S和11S的分子质量与上述一致。

图5b为所提纯的7S和11S样品的SE-HPLC色谱图，7S和11S的SE-HPLC色谱图中最大的峰与7S和11S标品特征峰出峰时间一致，表明所提纯样品为7S和11S。

图5 7S和11S标品、样品的SE-HPLC色谱图

2.3 SE-HPLC法定量分析大豆7S和11S球蛋白的纯度

按1.3.4的方法进行试验，以10倍信噪比确定定量限，得到7S和11S纯度分析标准曲线方程，结果见表1。7S和11S均具有良好的线性关系(R2>0.970 0)，说明用该标准曲线方程分析结果具有可靠性，可用于实际样品的分析。按1.3.4.3的方法进行试验，将得到峰面积带入表1中的线性方程求得7S和11S的含量(相对于7S和11S标品)，进而求得7S和11S的纯度。本试验所制得7S和11S的纯度分别达到86.3%和92.0%。

表1 7S和11S含量分析的线性方程、线性范围、相关系数

3 结论

本研究采用SE-HPLC法定量分析大豆7S和11S球蛋白的分子质量和纯度，提供了一种快速鉴定大豆7S和11S球蛋白分子质量和纯度的方法，对SE-HPLC的色谱条件进行优化，结果表明最佳的SE-HPLC色谱条件是：洗脱液(水/乙腈)70/30，洗脱液流速1.0 mL/min，进样量10 μL。采用SE-HPLC法分析7S和11S的分子质量，分子质量标准曲线方程为Log (M)=-0.222 1x+3.878 9，线性相关系数为R2=0.996 9。将所提纯的7S和11S样品的分子质量与7S和11S标品特征峰分子质量进行比对，表明所提纯样品为7S和11S。根据优化的色谱条件对7S和11S标品进行采样，以10倍信噪比确定定量限，得到7S(y=299.59x+3.771 2，R2=0.979 2)和11S(y=197.08x+4.148 5，R2=0.986 1)纯度分析标准曲线方程，该标准曲线方程可以用于7S和11S纯度的分析。本试验所制得7S和11S的纯度分别达到86.3%和92.0%。

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Molecular Weight and Purity of Soy 7S, 11S Globulin Analyzed by Size Exclusion-High-Performance Liquid Chromatography

Gao Xueli1,2,3Chen Fusheng1Zhang Lifen1Guo Xingfeng1Fan Mingtao3

(College of Food Science and Technology，Henan University of Technology1, Zhengzhou 450001) (College of Food Science, Xuchang University2, Xuchang 461000) (College of Food Science, Northwest A&F University3, Yangling 712100)

In this paper, the molecular weight and purity of soy 7S, 11S globulin were quantificationally analyzed by SE-HPLC. Firstly, the optimization of the SE-HPLC chromatographic conditions were carried out, and the optimal SE-HPLC chromatographic conditions were: eluant (water/acetonitrile) 70/30, flow rate of eluant 1.0 mL/min, sample size 10 μL. Secondly, the standard curve of molecular weight analysis was drawn, and the standard curve equation of molecular weight was Log (M)=-0.222 1x+3.878 9, and the linear correlation coefficient wasR2=0.996 9. With the 10 times signal-to-noise ratio quantitative limit, the standard curve equation of 7S molecular purity (y=299.59x+3.7712,R2=0.979 2) and 11S molecular purity (y=197.08x+4.1485,R2=0.986 1) were obtained. Finally, this study provided a quick identification method of the molecular weight and purity of soy 7S, 11S globulin. The purity of 7S or 11S was respectively 86.3% and 92.0%.

size exclusion-high-performance liquid chromatography, soy 7S and 11S globulin, molecular weight, purity

863计划(2013AA102208-5)，“十二五”国家科技支撑计划(2014BAD04B10)

2015-07-18

高雪丽，女，1982年出生，博士，食品蛋白质资源开发及利用

陈复生，男，1963年出生，教授，食品蛋白质资源开发及利用 樊明涛，男，1963年出生，教授，生物技术、食品蛋白质资源开发及利用

TS21

A

1003-0174(2017)02-0098-06