橄榄油中蜡含量测定方法的改进及气质联用分析

柴 杰 薛雅琳 金青哲 王兴国 张 东

(江南大学食品学院1，无锡 214122) (国家粮食局科学研究院2，北京 100037)

橄榄油中蜡含量测定方法的改进及气质联用分析

柴 杰1,2薛雅琳2金青哲1王兴国1张 东2

(江南大学食品学院1，无锡 214122) (国家粮食局科学研究院2，北京 100037)

利用硅胶固相萃取柱净化，四氯化碳洗脱，从橄榄油中分离出蜡质组分，内标法定量，气相色谱测定蜡含量，气相色谱-质谱联用分析蜡质组成。结果表明，加标回收率为79.95%～94.03%，相对标准偏差(RSD)为0.85%～1.70%。GC-MS分析得出蜡质主要成分为长碳链脂肪酸和长碳链脂肪醇组成的长碳链脂肪族蜡质，相同碳数及饱和程度的蜡质有多种组成，单不饱和蜡质主要由棕榈油酸(C16∶1)、油酸(C18∶1)与相应的长碳链脂肪醇(C20～C32)组成，含量高于饱和蜡质。

橄榄油 蜡含量 固相萃取 气相 气质联用

初榨橄榄油是采用机械压榨等物理方式直接从油橄榄果中制取[1]，因丰富的营养成分，宜人的香气深受消费者的青睐，被誉为“液体黄金”。巨大的经济利益诱使生产商将低等级的精炼橄榄油、混合橄榄油和橄榄果渣油掺入初榨橄榄油中以次充好，牟取暴利。目前橄榄油掺伪研究方法包括液相色谱法[2]、核磁共振光谱法[3]、红外线光谱法[4]、荧光光谱法[5]和化学计量分析法[6]。

橄榄油中含有多种蜡质，包括长碳链脂肪酸和短碳链脂肪醇(C1～C6)或长碳链脂肪醇(C22～C28)形成的脂肪族蜡质、苯甲醇酯、甾醇酯等，主要以长碳链脂肪酸与长碳链脂肪醇形成的脂肪族蜡质为主[7]。不同等级的橄榄油蜡含量不同，初榨橄榄油中蜡含量少，通过测定橄榄油中蜡含量能有效判定橄榄油等级，国际橄榄油协会(IOC)及中国国家标准委员会通过测定长碳链脂肪族蜡质含量制订了COI/T.20/Doc.No.28/(2010)[8]和GB/T 22501—2008[1]2个标准，标准规定根据C40～C46偶碳数脂肪族蜡质含量鉴定橄榄油等级。

IOC及GB方法利用人工装填的硅胶柱层析洗脱，将弱极性的蜡质组分先于甘油三酯洗脱下来，内标法定量，气相色谱法测定蜡含量，此方法不破坏蜡质组成，能准确定量蜡质组分，但人工装填层析柱等步骤耗时耗力，此后有学者优化了前处理，Amelio等[9]利用液相色谱分离蜡质组分，简化了步骤。有学者利用气相色谱测定蜡含量及气相色谱质谱联用分析蜡质组成，气相色谱根据蜡质碳原子数及不饱和度进行分离从而测定总量，利用GC-MS可对蜡质进行定性分析及同分异构组成研究。Reiter等[10]利用SPE固相萃取小柱分离茴香和香菜种子油中蜡质，气相色谱法测定蜡含量，方法节约了前处理时间。Bianchi等[7]通过GC-MS分析橄榄果渣油的蜡质组分，其主要成分为油酸或棕榈酸与长碳链脂肪醇(C22～C28)形成的单不饱和长碳链脂肪族蜡质。Reiter等[11]通过质谱分析得出，橄榄油中蜡质含有不同碳链长度的酯类，包括短碳链脂肪族酯类，长碳链脂肪族饱和酯类，长碳链脂肪族不饱和酯类，苄基酯，二萜酯等。

本试验利用SPE固相萃取小柱分离橄榄油中蜡质，内标法定量，气相色谱测定C40～C46偶碳数脂肪族蜡质含量，建立了一种快速简便的橄榄油蜡含量测定方法，有效鉴定橄榄油等级，同时利用GC-MS分析了橄榄油中C40～C46偶碳数脂肪族蜡质组成，为蜡质组分分析提供数据基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

特级初榨橄榄油，混合橄榄油；正己烷(色谱纯)，正庚烷(色谱纯)：Fisher Science；硝酸银、四氯化碳、正己烷、乙醚：北京化工试剂厂；花生酸月桂醇酯(C32酯)、C40酯标准品、苏丹Ⅰ：Sigma公司；硅胶(100～200 μm)：青岛海洋化工工厂。

GC2010气相色谱仪，SPL进样口，FID检测器：岛津公司；Agilent 7890-5975C气相色谱-质谱联用，DB-5HT毛细管色谱柱(30 m×0.25 mm×0.1 μm)：Agilent公司；SPE固相萃取小柱(1 g硅胶6 mL容量)：上海安谱科学仪器公司；SX-4-10马弗炉：天津泰斯特仪器有限公司；R-215型旋转蒸发仪，瑞士Buchi公司；玻璃层析柱(d=1.5 cm,l=40 cm)。

1.2 试验方法

1.2.1 柱层析分离蜡组分

硅胶固相萃取柱，上样前用正己烷活化，准确称取橄榄油20～25 mg，加入200 μL 0.01 mg/mL内标物(花生酸月桂醇酯，C32酯)，上样，2次200 μL正己烷清洗试管使转移彻底，6 mL四氯化碳洗脱，收集洗脱液，弱氮气流吹干溶剂，加150 μL正庚烷，气相色谱及GC-MS分析。

人工装填硅胶柱分离橄榄油中蜡质组分同GB/T 22501—2008。

1.2.2 气相色谱法测定蜡含量

气相色谱条件：DB-5HT毛细管色谱柱(30 m×0.25 mm×0.10 μm)，程序升温：初始温度200 ℃，保持1 min，20 ℃/min程序升温至300 ℃，2 ℃/min程序升温至346 ℃，保持26 min；高纯氦气，流速1.5 mL/min；SPL进样口，温度340 ℃，进样量1.0 μL，分流比10∶1；FID检测器，350 ℃。

蜡含量=[A(W)×m(IS)×1 000]/[A(IS)×m]

式中：A(W)：蜡质(C40酯～C46酯)峰面积；m(IS)：内标质量/mg；A(IS)：内标物峰面积；m：样品质量/g。

总含蜡量=Σ [C40酯含量～C46酯含量]

1.2.3 GC-MS分析

气相色谱条件：同1.2.2；MS条件：电子轰击源(EI源)，温度230 ℃，电子能量70 eV，传输线温度280 ℃，溶剂延迟8 min，质量范围(m/z)：50～800。

1.2.4 蜡质定性分析

采用蜡质酯基断裂后形成的脂肪酸和脂肪醇离子碎片确定蜡质结构，以定性碎片离子占该峰总定性碎片离子的百分含量确定蜡质组成，同Bianchi、Reiter等[7, 10-11]的分析方法。

2 结果与讨论

2.1 橄榄油蜡含量测定

橄榄油中蜡质以C40～C46偶碳数的脂肪族蜡质为主，不饱和蜡质出峰先于饱和蜡质[11]，蜡含量以C40酯～C46酯偶碳数脂肪族蜡质总和表示，不同等级的橄榄油蜡含量不同，初榨橄榄油中蜡含量少，混合橄榄油中蜡含量高。根据标准品出峰及文献谱图对照，蜡质组成依次为，1∶WE40∶1，2∶WE40∶0，3∶WE42∶1，4∶WE42∶0，5∶WE44∶1，6∶WE44∶0，7∶WE46∶1，8∶WE46∶0。相同碳链长度的蜡质不饱和蜡质含量高于饱和蜡质，Reiter等[11]也得出相同结论。

图1 特级初榨橄榄油中蜡含量气相色谱图

2.1.1 方法的线性范围及检出限

由IOC及GB方法可知，C40酯等脂肪族蜡质与花生酸月桂醇酯(C32酯)的响应值比近似为1，将C40酯标准品用正庚烷稀释成0.19、0.095、0.047 5、0.019、0.009 5、0.000 95 mg/mL系列质量浓度，按照1.2.2气相色谱条件进行测定。峰面积为纵坐标y，C40酯质量浓度为横坐标x，曲线方程为y=1.959 8×106x-2.330 5×103，相关系数R2为0.999 4，线性范围0.000 95～0.19 mg/mL，表明在0.000 95～0.19 mg/mL范围内线性关系良好。方法的最低检出限以基线噪音的3倍所对应的质量浓度，该方法的最低检出限为0.095 μg/mL。

2.1.2 方法的精密度、加标回收率及准确度

取一橄榄油样对其蜡含量进行6次重复试验测定，蜡含量分别为68.74、70.22、68.59、65.74、65.95、65.61 mg/kg，均值为67.47 mg/kg，变异系数为2.91%。再取18份该橄榄油油样，每6份为1组，分为3组，每组依次加入0.011 9 mg/mL C40酯正己烷溶液60、120、200 μL，按1.2.1中改进法及1.2.2进行蜡质分离及蜡含量测定。平均回收率及每个加标量条件下的6次试验的相对标准偏差(RSD)见表3。

表1 橄榄油中C40酯加标回收率及准确度(n=6)

方法加标回收率为79.95%～94.03%，试验过程中相对标准偏差(RSD)为0.85%～1.70%(n=6)，表明该方法精密度及准确度良好。

2.1.3 实际样品测定及与GB/T 22501—2008方法比较

选取2个橄榄油样品，分别采用改进方法和GB/T 22501—2008方法对其总蜡含量及C40酯～C46酯各单酯含量进行测定，测定结果见表2。比较得出，2种方法都能有效的测定橄榄油中总蜡含量及蜡质各单酯含量，且2种方法在总蜡含量及C40～C46酯各单量的测定结果相近。

表2 实际样品测定与国标法比较(n=2)

改进的方法主要优化了前处理，采用分流进样口进样。SPE固相萃取小柱能有效替代人工装填的硅胶柱，缩短前处理时间，提取效率快，同时避免人工装柱及洗脱的不稳定性，耐用性强，在色谱条件选择，使用SPL分流进样，减少了对色谱柱的污染，选用DB-5HT耐高温低流失气相色谱柱，基线稳定，耐受较高温度的同时确保良好的分离效果，色谱图出峰尖锐。2种方法比较见表3。

表3 IOC法、GB法与改进法方法比较

2.2 橄榄油蜡质GC-MS分析

气相色谱中每一个蜡质峰中包含相同碳数、相同饱和程度的多种不同脂肪酸-脂肪醇组成的蜡质[10]，蜡质结构表示为R1-COO-R2，R1代表组成蜡质的长碳链脂肪酸组分，R2代表组成蜡质的长碳链脂肪醇组分，饱和蜡质中检测出母离子峰[M]+，因Mclafferty重排产生的[R1CO2H2]+，[R1CO]+和[R2-1]+，不饱和蜡质中检测出Mclafferty重排产生的[R1CO2H2]+， Mclafferty裂解蜡质中不饱和脂肪酸组分产生的[R1CO-1]+，同Reiter等[11]的测定结果。

根据Bianchi和Reiter等[7, 11]的方法，采用蜡质酯基断裂形成的脂肪酸和脂肪醇离子碎片确定蜡质结构，以定性碎片离子占该峰总定性碎片离子的百分含量确定蜡质组成，以[R1CO2H2]+、[R1CO]+和[R2-1]+碎片离子确定饱和蜡质的中各组成的百分含量，以[R1CO2H2]+和[R1CO-1]+碎片离子确定不饱和蜡质中各组成的百分含量，分析特级初榨橄榄油中蜡质组成成分，测定结果见表4。

表4 特级初榨橄榄油蜡质组成成分质谱鉴定结果

注：a:CN蜡质碳链长度；DB双键数；WE蜡质；b:acid-alcohol，组成蜡质的脂肪酸-脂肪醇；c:该种脂肪酸-脂肪醇组成占此碳数蜡质组成的百分含量；d:离子碎片的相对百分峰度；e:[]表示未检出。

通过GC-MS分析可对特级初榨橄榄油中C40～C46偶碳数脂肪族蜡质中相同碳数单不饱和蜡质及饱和蜡质组成进行确定，根据表4可知，相同碳数及相同饱和程度的蜡质有多种不同的脂肪酸-脂肪醇组成，不饱和长碳链脂肪族蜡质主要由棕榈油酸(C16∶1)和油酸(C18∶1)与长碳链脂肪醇(C20～C32)组成，油酸(C18∶1)与长碳链脂肪醇组成的不饱和脂肪族蜡质含量更高。饱和脂肪族蜡质主要为棕榈酸(C16∶0)、硬脂酸(C18∶0)、花生酸(C20∶0)、山嵛酸(C22∶0)与相应的长碳链脂肪醇(C20～C32)组成。相同碳数脂肪族蜡质，单不饱和蜡质出峰先于饱和蜡质，单不饱和蜡质含量高于饱和蜡质含量，分析结果与气相色谱法推断结果相同。

3 结论

3.1 建立了一种快速准确测定橄榄油蜡含量的方法，方法加标回收率为79.95%～94.03%，试验过程中相对标准偏差(RSD)为0.85%～1.70%。前处理利用商业成品SPE固相萃取小柱，操作简便、重复性好，有效避免人工装填硅胶柱引起的误差，有机溶剂使用量少，总测定时间短，提取效率快，耐用性强。

3.2 利用碎片离子峰进行定性，在不经皂化破坏蜡质结构的条件下对脂肪族蜡质组成进行分析，分析了C40～C46饱和及单不饱和脂肪族蜡质的组成，相同碳数及饱和程度的蜡质有多种组成，单不饱和脂肪族蜡质含量高于饱和脂肪族蜡质。

[1]GB/T 22501—2008 动植物油脂 橄榄油中蜡含量的测定 气相色谱法[S]. 2008 GB/T 22501—2008 Animal and vegetable fats and oils—Determination of wax content of olive oils by gas chromatography [S]. 2008

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Improvement of the Determination Method of Wax Content in Olive Oils and Analysis by GC-MS

Chai Jie1,2Xue Yalin2Jin Qingzhe1Wang Xingguo1Zhang Dong2

(School of Food Science, Jiangnan University1, Wuxi 214122) (Academy of State Administration of Grain2, Beijing 100037)

The waxy component of olive oil was obtained by silica gel solid phase extraction column purification, carbon tetrachloride elution, and internal standard method quantification, subsequently the wax content measured by gas chromatography and the waxiness composition analysized by gas chromatography-mass spectrometry. The results showed that the adding standard recovery was 79.95%～94.03%, with the relative standard deviation (RSD) of 0.85%～1.70%. With respect to the GC-MS analysis, the main component of the wax was long carbon chain fatty esters and long carbon chain aliphatic series waxiness which were composed of long carbon chain fatty alcohol. The waxiness of the same carbon number and same degree of saturation had various components, and monounsaturated waxiness was mainly composed of palmitoleic acid (C16∶1), oleic acid (C18∶1) and the corresponding long carbon chain fatty alcohol (C20～C32), the content of unsaturated waxiness were higher than saturated waxiness.

olive oil， wax content， solid-phase extraction，gas chromatography， GC-MS

公益性行业(粮食)科研专项(201313006-3)

2015-07-21

柴杰，男，1990年出生，硕士，粮油食品检验

薛雅琳，女，1960年出生，教授级高级工程师，粮油质量与检测

TS227

A

1003-0174(2017)02-0135-05