光照强度对南方红豆杉紫杉醇含量及相关酶基因表达的影响

2017-08-07秦海燕范慧艳李石清张水利张春椿

浙江中医药大学学报 2017年7期

秦海燕范慧艳李石清张水利张春椿

浙江中医药大学杭州 310053

浙江中医药大学杭州 310053

[目的]研究光照强度对南方红豆杉中紫杉醇和10-脱乙酰基巴卡丁Ⅲ（10-deacetylbaccatin III,10-DABⅢ）含量变化，探讨其可能的环境适应机制。[方法]通过高效液相色谱法（high performance liquid chromatography,HPLC）测定不同遮光率（50%、70%和90%）分别遮光30、60、90d后紫杉醇和10-DABⅢ含量；通过PCR法测定相关酶基因表达量。[结果]光照强度能够影响紫杉醇的积累。遮光0～90d，空白组紫杉醇和10-DABIII含量呈下降趋势，各遮光组呈先升后降的趋势，但差异无统计学意义(P＞0.05)。其中50%和70%遮光组明显高于空白组及90%遮光组（P＜0.01）。此外，光照对紫杉二烯 5α-羟基化酶（taxane 5α-hydroxylase,TH5α）、紫杉烷 7β-羟基化酶（taxane 7β-hydroxylase,7β）和紫杉烷 14β-羟基化酶（taxane 14βhydroxylase,14OH）基因表达也存在明显影响，70%遮光组TH5α基因表达量随遮光时间延长而增加，14OH基因则下降（P＜0.01）。[结论]本研究初步得到光照因素可以影响南方红豆杉次生代谢产物的合成及相关酶基因的表达，适当的遮光（70%遮光）可以提高紫杉醇的含量，且遮光3月内紫杉醇含量稳定。

南方红豆杉；遮光；HPLC；PCR法；紫杉醇；10-DABⅢ；基因表达

南方红豆杉(Taxus chinensis var.mairei)是中国地方性物种，在长江以南普遍存在[1]。紫杉醇(Paclitaxel,商品名Taxol）作为红豆杉属植物的重要次生代谢产物，是当前公认的高效广谱抗癌药物之一[2]。但紫杉醇在红豆杉中含量极低，且红豆杉资源有限，急切需要探寻一种促紫杉醇增产、经济可行的新技术。近年来研究表明，环境因子可以影响红豆杉的生长。关品高等[3]发现海拔、光照、温度等环境因素对云南红豆杉紫杉醇含量具有明显影响。杨逢建等[4-6]认为适量光照有利于南方红豆杉叶片中紫杉醇的合成，但是光照过强反而会降低其含量。苗莉云等[7]运用实时荧光定量PCR技术发现，在红豆杉细胞中过表达Bapt基因可以提高紫杉醇产量。

近年来，利用高效液相色谱法同时测定紫杉醇和10-脱乙酰基巴卡丁Ⅲ（10-deacetylbaccatinⅢ,10-DABⅢ）含量的方法已有报道[8-9]，且利用实时荧光定量PCR技术检测基因表达的方法已十分成熟[10-13]。本研究采用高效液相法及实时荧光定量PCR技术，测定不同遮光率（50%、70%和90%）分别遮光30、60和90d后紫杉醇和10-DABⅢ含量以及合成过程中紫杉二烯 5α-羟基化酶（taxane 5α-hydroxylase,TH5α）、紫杉烷 7β-羟基化酶（taxane 7β-hydroxylase,7β）和紫杉烷 14β-羟基化酶（taxane 14β-hydroxylase,14OH）基因表达，以期找到能够切实提高紫杉醇含量、降低生产成本的合适方法。

1 材料与方法

1.1 仪器 WatersE2695全自动高效液相色谱仪（Waters 2996 PDA 检测器），MS105DU半微量分析天平（METTLER TOLEDO），Quawell Q5000微量紫外可见分光光度计、Tanon-4100数码凝胶图像处理系统（天能科技有限公司），PCR仪（BioRad MyCycler-TMThermal Cycler,580BR11767），荧光定量PCR仪（BioRad C1000 TouchTMThermal Cycler,785BR10301）。

1.2 药材选取长势良好、高度相近的5年生南方红豆杉（杭州富阳皇天塘红豆杉基地，海拔561米，N29.53，E119.53），每 6株分为 1组，设置空白（不遮光）组，50%遮光组、70%遮光组和90%遮光组。分别采摘遮光前、遮光30d、遮光60d和遮光90d的中段枝叶，自然阴干备用。

1.3 试剂多糖多酚植物总RNA提取试剂盒（TIANGEN BIOTECH,批号：DP441）、反转录试剂盒（PrimeScriptTMRT Reagent Kit,批号：RR037A）、引物（上海生工生物工程有限公司合成）、qRT-PCR试剂盒（SYBR Premix Ex TaqTM,批号：RR420A）、紫杉醇标准品（上海诗丹德生物技术有限公司，批号：305/18638)、10-脱乙酰巴卡丁Ⅲ标准品（上海诗丹德生物技术有限公司，批号：1942/18641)。

1.4 实验方法

1.4.1 色谱条件色谱柱：inertsil ODS-SP（250×4.6mm,5μm）；流动相：甲醇∶水（0～16min，44%～56%；16～20min,44%～62%；20～25min，62%～67%；25～30min，67%～70%；30～35min，70%～62%；35～40min,62%）[14-15]；检测波长：227nm；流速：1.0mL·min-1；柱温：30℃；进样量：10μL。每个样本重复3次。

1.4.2 标准曲线线性关系考察将紫杉醇和10-DABⅢ标准品分别配制成浓度为 0.67、0.296、0.25125、0.1675、0.08375、0.041875mg·mL-1和 1.04、0.552、0.39、0.26、0.13、0.0652mg·mL-1。按上述色谱条件进样，以峰面积（Y）对浓度（X）进行线性回归。

1.4.3 试样制备各遮光组和空白组共5个批次阴干的南方红豆杉枝叶，组间内的6株样本混合打粉，称取5.0g用50mL甲醇浸润20min，超声50min离心，重复两次；上清液30℃减压旋干；用45mL甲醇和5mL蒸馏水溶解，用50mL正己烷萃取至上层无色；甲醇相30℃减压蒸干用50mL二氯甲烷溶解，蒸馏水萃取两次除杂；二氯甲烷相真空浓缩至干，用5mL色谱纯甲醇溶解、定容，0.45μm膜过滤后进行HPLC检测。

1.4.4 加样回收率试验根据测得的样品中10-DABⅢ、紫杉醇的含量，在原药材粉末中分别添加样品中10-DABⅢ、紫杉醇含量80%、100%和120%的标准品甲醇溶液，平行3份，按照“1.4.3”项下方法制得溶液，测定其含量。

1.4.5 植物总RNA提取及电泳检测分别称取各组各株南方红豆杉枝叶0.75mg，用液氮研磨成粉末，参照多糖多酚植物总RNA提取试剂盒方法提取植物总RNA，-80℃保存。取5μL样本RNA，150V电泳检测8min。

1.4.6 实时荧光定量PCR（qPT-PCR）检测基因表达以RNA为模板按反转录试剂盒说明书操作得到cDNA，存于-80℃，反应条件为 37℃ 15min，85℃ 5s，4℃ 20min。按qRT-PCR试剂盒说明书加样，引物序列（表 1），反应条件：95℃预变性 3min，95℃,变性 5s，60℃退火 30s，65℃延伸 5s，39个循环。

1.5 统计学方法用SPSS13.0统计软件分析处理数据。计量数据用±s表示，各组间比较采用t检验，组间比较用 LSD法，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 实验结果

2.1 标准曲线线性关系考察紫杉醇在40～300μg·mL-1具有良好的线性关系，回归方程为Y=18864X-10669，相关系数（r）为 0.9997；10-DABⅢ在 60～600 μg·mL-1具有良好的线性关系，回归方程为Y=14388X-40545，相关系数（r）为 0.9996。

2.2 加样回收实验计算出10-DABⅢ的平均回收率为98.73%，RSD为1.56%；紫杉醇的平均回收率为96.28%，RSD为1.34%，符合要求。

表1 紫杉烷类生物合成关键酶基因定量PCR引物序列Tab.1 Taxane biosynthesis Key enzyme gene Quantification PCR primers

2.3 含量测定结果 5年生南方红豆杉不同遮光干预后枝叶中紫杉醇和10-DABⅢ含量随遮光时间变化的结果（表2）。遮光处理组中紫杉醇和10-DABⅢ含量较同时间内空白组均有较大差异，有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01）。相对于 50%和 90%遮光组而言，70%遮光条件下紫杉醇和10-DABⅢ两种化学物质的含量一直保持高稳定状态。遮光90d，70%遮光组与50%和90%遮光组比较，紫杉醇含量分别增加了33.49%和74.44%；遮光90d，70%遮光组与50%和90%遮光组比较，10-DABⅢ含量分别增加了43.38%和86.72%。表2显示，遮光率相同，空白组紫杉醇和10-DABⅢ含量随遮光时间增加呈下降趋势，各遮光组随遮光时间延长呈先升后降的趋势，但无统计学差异（P＞0.05）。

表2 不同遮光处理紫杉醇和10-DABⅢ的含量测定结果(±s，mg·g-1)Tab.2 The results of the determination of paclitaxel and 10-DABⅢ in different shading treatments(±s，mg·g-1)

注：与空白组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。Note:Compared with the control group,*P＜0.05,**P＜0.01.

组别 10-DABⅢ含量遮光0d 遮光30d 遮光60d 遮光90d紫杉醇含量遮光0d 遮光30d 遮光60d 遮光90d空白组50%遮光组70%遮光组90%遮光组0.1136±0.0069 0.1189±0.0051 0.1050±0.0080 0.1316±0.0023*0.1013±0.0007 0.2217±0.0035**0.1852±0.0054**0.1245±0.0088**0.0852±0.0006 0.1147±0.0069**0.1540±0.0071**0.0824±0.0032 0.0753±0.0013 0.0853±0.0007**0.1223±0.0051**0.0655±0.0008**0.1096±0.0061 0.1056±0.0013 0.1157±0.0045 0.0976±0.0026*0.0957±0.0016 0.2108±0.0035**0.1719±0.0054**0.1102±0.0088**0.0855±0.0044 0.1127±0.0031**0.1488±0.0022**0.0748±0.0040*0.0731±0.0021 0.0869±0.0037**0.1160±0.0026**0.0665±0.0041

2.4 荧光定量检测结果光照对紫杉醇相关酶基因的表达也存在明显影响。遮光时间相同，各遮光组TH5α、7β、14OH 3种基因的表达较空白组均存在差异。由图1可知，遮光30d，50%遮光组较空白组14OH表达显著性下降，差异有统计学意义（P＜0.01），70%和90%遮光组显著性升高，差异有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01）。遮光 60d，50%遮光组 TH5α 低于空白组，差异有统计意义（P＜0.05），70%和90%遮光组TH5α高于空白组，但无统计学差异（P＞0.05)，50%和70%遮光组14OH分别低于和高于空白组，差异有统计意义（P＜0.05，P＜0.01），70%遮光组 7β 表达显著性低于空白组，差异有统计意义（P＜0.01）。遮光 90 d，14OH 和TH5α差异较为显著，70%遮光组TH5α表达量高于空白组，差异有统计意义（P＜0.01），50%和 90%遮光组14OH表达量低于空白组，差异有统计意义（P＜0.05，P＜0.01）。遮光强度相同，不同遮光时间各基因表达量均有较大差异，其中7β和14OH差异尤其显著。空白组7β基因表达随遮光时间延长逐渐下降，差异有统计意义（P＜0.05，P＜0.01）。70%遮光组 TH5α基因表达量随遮光时间延长而增加，14OH基因则下降，差异有统计意义（P＜0.05，P＜0.01）。90%遮光组14OH和7β的含量随遮光时间延长而下降，差异有统计意义（P＜0.01）。

图1 TH5α、7β和14OH基因表达量随时间变化统计图Fig.1 TH5α,7β and 14OH gene expression changes over time

3 讨论

目前，紫杉醇的生物合成途径基本阐明。紫杉醇及其相关的带有C13位侧链化合物的生物合成途径可分为紫杉烷碳环系统的生物合成、侧链的生物合成、紫杉烷系统和侧链的酯化反应[16]。TH5α是第一个羟基化反应中的催化酶，不仅催化核心骨架C5特异性地添加一个羟基，而且还催化C4(5)的双键转移到C4(20)位置上，生成紫杉-4(20),11(12)-二烯-5α醇。由于此反应速度很慢，因此TH5α很可能是紫杉醇骨架合成的限速酶[17-18]。而7β催化C7取代氧化反应，合成半合成前体巴卡亭Ⅲ[11]。因此，TH5α、紫杉烷 7β-羟基化酶基因是紫杉醇及其半合成前体巴卡亭Ⅲ生物合成调控的重要靶标[10]。而14OH是存在于C-l3氧取代的紫杉烷合成分支途径中的一种P450单加氧酶，与紫杉醇的含量成负相关[12-13]从而调控紫衫烷类合成。C14氧取代的紫杉烷类物质是紫杉醇合成通路中影响紫杉醇含量的一个重要分支，近年来研究证明其关键调控酶是14OH[19]。

次生代谢物质的产生是外界刺激因素、发育程度及组织分化通过作用于生物合成基因表达从而进行调控，研究发现4组遮光条件对关键酶基因的表达起到一定作用，强光照可使植物体内部分酶失活，影响植物代谢，影响关键酶表达及紫杉烷类物质合成，实验表明，70%的遮光度可提高TH5α基因表达量，较为理想。70%遮光组和90%遮光组内14OH基因酶随遮光时间延长而减少。空白组内7β基因酶随遮光时间延长而减少，有可能强光照抑制7β基因酶表达。故可建议药农可对南方红豆杉进行适度的遮光。

红豆杉每年都在3月下旬至4月下旬发新芽，从第1年4月份到次年3月份形成一个枝叶生长循环[20]。红豆杉为喜阴植物，在7～9月光照最强的时间内，不利于其次生代谢合成紫杉醇。本研究通过对南方红豆杉进行适当遮光处理后发现，无论是次生代谢产物还是相关酶基因表达都有所增加，紫杉醇和10-DABⅢ的含量变化趋势与TH5α基因表达一致，而且适当的遮光强度可以促进紫杉醇的积累。遮光70%，有利于TH5α基因表达合成紫杉醇重要前体物质，进而促进紫杉醇的积累，且遮光3月内紫杉醇含量稳定。由此可知，在夏季较高光强度下，可以通过对南方红豆杉采取遮光处理，增加紫杉醇的生物合成来提高产量，且适当的遮光时间内紫杉醇含量保持稳定。紫杉醇作为一种次生代谢产物，其合成同时受到遗传物质和外界环境的影响。结合本实验紫杉烷类物质积累的变化，发现大部分基因酶和相对应的紫杉烷类成分变化呈相同趋势，更加明确表明了关键酶表达量调控着紫衫烷类生物合成，为从基因分子机制提高紫衫烷类成分奠定理论依据。

综上所述，外界刺激因素极大的影响了关键酶基因表达量。但实验发现紫杉烷类生物合成关键酶基因14OH表达量与紫杉醇和10-DABⅢ的含量相差甚远。有可能由于紫杉醇生物合成途径需多种酶共同协调催化，其他的合成酶表达量直接影响紫衫烷类产量。或者又因为酶的相对专一性，可催化多种反应，不一定全部作用于紫杉烷的生物合成，即使作用于紫杉烷生物合成途径，又因分支途径太多而没有促进研究组所测试的紫衫烷类成分。亦可能是由于紫杉烷类的过度积累对紫杉烷合成关键酶的活性起到了反馈抑制作用及紫杉烷类产物的部分降解所导致。至于具体的机制，则需要进一步探究。

References：

[1] 王昌伟,仝川,李文建,等.遮光对南方红豆杉生长及紫杉醇含量的影响[J].生态学杂志,2008,27(8):1269-1273.WANG Changwei,TONG Chuan,LI Wenjian,et al.Effects of shading on Taxus chinensis var.mairei growth and its taxol content[J].Chinese Journal of Ecology,2008,27(8):1269-1273.

[2] Ji Y,Bi JN,Yan B,et al.Taxol-Produeing fungi:a new approach to industrial production of taxol[J].Chinese J Bioteehnol,2006,22(11):l-6.

[3] 关品高,刘江华.云南红豆杉生长特性及其人工种植产业发展研究[J].林业调查规划,2010,35(3):58-61.GUAN Pingao,LIU Jianghua.Study on growth characters of Taxusy unnanensis and development of its plantation industry[J].Forest Inventory and Planning,2010,35(3):58-61.

[4] 杨逢建,庞海河,祖元刚,等.南方红豆杉生长发育及其紫杉醇含量与环境因子的关系[J].植物研究,2010,30(10):742-746.YANG Fengjian,PANG Haihe,ZU Yuangang,et al.Relationships between the growth and taxolcontentof Taxus chinensis var.mairei and environment factors[J].Bulletin of Botanical Research,2010,30(10):742-746.

[5] 周海坤,周云.云南红豆杉枝叶紫杉醇含量影响因素概述[J].安徽农业科学,2015,43(1):106-109.ZHOU Haikun,ZHOU Yun.Study on factors affecting taxol content in leaves and twigs of Taxus yunnanensis[J].Journal of Anhui Agri.Sci,2015,43(1):106-109.

[6] 杨逢建,庞海河,张学科,等.光胁迫对南方红豆杉叶片中叶绿体色素和紫杉醇含量的影响[J].植物研究,2007,27(5):556-558.YANG Fengjian,PANG Haihe,ZHANG Xueke,et al.Effect of light stress on the content of chloroplast pigment and taxol in the leaves of Taxus chinensis var.mairei[J].Bulietin of Botanical Research,2007,27(5):556-558.

[7] 苗莉云,张鹏,刘博,等.过表达Bapt基因提高中国红豆杉细胞的紫杉醇产量[J].中国生物化学与分子生物学报,2013,29(6):549-554.MIAO Liyun,ZHANG Peng,LIU Bo,et al.Overexpression of a C-13 phenylpropanoid side chain-co a acetyltransferase gene promotes taxol yield in Taxus chinensis cells[J].Chinese Journal of Biochemistry and Molecular Biology,2013,29(6):549-554.

[8] 陈立国,刘程惠,何克江,等.HPLC法对5种红豆杉属植物中紫杉烷类化合物成分的分析[J].分析试验室,2007,26(s1):58-61.CHEN Liguo,LIU Chenghui,HE Kejiang,et al.Analysis of Taxane Compounds in Five Taxus Species by HPLC[J].Chinese Journal of Analysis Laboratory,2007,26(51):58-61.

[9] 王文芝.西藏红豆杉中紫杉醇及相关紫杉烷含量的高效液相色谱分析[J].色谱,1997,15(3):254-256.WANG Wenzhi.Reversed-phase high performance liquid chromatographic(RP-HPLC)analysis of taxol and related taxanes extracted from Taxus Wallichiana Zucc[J].Chinese Journal of Chromatography,1997，15（3）:254-256.

[10] 骆建新,陈永勤,刘占杰.紫杉醇生物合成相关酶基因的克隆与表达[J].中国生物工程杂志,2003,23(6):36-40.LUO Jianxin,CHEN Yongqin,LIU Zhanjie.Cloning and expression of genes responsible for taxol biosynthesis[J].China Biotechnology,2003,23(6):36-40.

[11] 燕丽娜,苏应娟,王艇.南方红豆杉紫杉烷7β-羟基化酶基因全长序列的克隆和进化分析[J].中山大学学报(自然科学版),2009,48(5):120-124,130.YAN Lina,SU Yingjuan,WANG Ting.Molecular cloning and evolutionary analysis of the full-length sequence of the Taxus wallichiana var.mairei taxoid 7-beta-hydroxylase gene[J].Acta Scientiarum Naturalium Uiverisitatis Sunyatseni.2009,48(5):120-124,130.

[12] 李凤岚,邱德有,马小军,等.利用RNAi抑制曼地亚红豆杉细胞紫杉烷14β-羟基化酶基因的表达[J].中国生物工程杂志,2009,29(5):55-60.LI Fenglan,QIU Deyou,MA Xiaojun,et al.Suppressionof taxoid 14b-hyd roxylase g ene expression in Taxus media via RNA interference[J].China Biotechnology,2009,29(5):55-60.

[13] 胡新玲,徐妙云,刘德虎,等.紫杉烷14β-羟基化酶基因片段的克隆及其植物表达载体的构建[J].分子植物育种,2006,4(2):243-250.HU Xinling,XU Miaoyun,LIU Dehu,et al.Cloning a DNA fragment of taxane 14β-hydroxylase gene and construction of its plant expresstion vectors for plant system[J].Molecular Plant Breeding,2006,4(2):243-250.

[14] Tamar S,Joseph M,Rinat M,et al.Combined weekly carboplatin and paclitaxel as primary treatment of advanced epithelial ovarian carcinoma[J].Gynecologic Oncology,2009,114(2):215-218.

[15] Shi QW,Kiyota H.New natural taxane diterpenoids from Taxus species since 1999[J].Chemistry&Biodiversity,2005,2(12):1597-1623.

[16] JENNEWEIN S,LONG R,WILLIAMS R M,et al.Cytochrome P450 taxadien 5α-hydroxylase,a mechanistically unusual monooxygenase catalyzing the first oxygenation step of Taxol biosynthesis[J].Chem.Biol.,2004,11(3):379-387.

[17] 翟芳,宋田青,肖文海,等.产5α羟化紫杉二烯醇人工酵母的组合设计构建[J].化工学报,2016,67(1):315-323.ZHAI Fang,SONG Tianqing,XIAO Wenhai,et al.Combinatorial design and construction of artificial yeast for production of taxadien-5α-ol[J].CIESC Journal,2016,67(1):315-323.

[18] 金晶,王微,邵妤,等.利用Bio-BglBrick方法表达紫杉醇生物合成酶[J].生物技术通讯,2014,25(5):616-620.JIN Jing,WANG Wei,SHAO Yu,et al.Expression of taxol biosynthetic enzymes via bio-bglbrick method[J].Letters in Biotechnology,2014,25(5):616-620.

[19] 高明波,张卫,李兴泰,等.联合调控对中国红豆杉细胞关键酶基因表达的影响[J].中国生物工程杂志,2010,30(8):31-36.GAO Mingbo,ZHANG Wei,LI Xingtai,et al.Expression Profiling of Genes Involved in Taxuyunnanine C Biosynthesis in Cell Suspension Cultures of Taxus chinensis by Repeated Elicitation with a Newly Synthesized Jasmonate,in situ Absorption and Sucrose Feeding[J].China Biotechnology,2010,30(8):31-36.

[20] 黄玺,李远.不同采集时间曼地亚红豆杉中紫杉醇含量分析[J].现代医药卫生,2013,29(12):1806-1808.HUANG Xi,LIYuan.Analysison taxolcontentsof Taxus media Hicksii in different harvest time[J].J Mod Med Health,2013,29(12):1806-1808.

Effects of Light Intensity on Taxol Content and Expression of Related Enzymes in Taxus Chinensis var.Mairei

QIN Haiyan,FAN Huiyan,LI Shiqing,et al Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou(310053),China

[Objective]The changes of paclitaxel and 10-deacetylbaccatin III(10-DABIII)in Taxus chinensis var.Mairei were studied,and the possible environmental adaptation mechanism was discussed.[Methods]The contents of paclitaxel and 10-DABIII were measured by high performance liquid chromatography(HPLC)at different shading rates(50%,70%and 90%)for 30,60 and 90d respectively.The expression of related enzyme gene was determined by quantitative real-time PCR.[Result]Light intensity can affect the accumulation of paclitaxel.The content of paclitaxel and 10-DABIII in the blank group decreased at 0 to 90d,and the shading group increased firstly and then decreased,but there was difference(P＞0.05).50%and 70%of the shading group were significantly higher than the blank group and 90%shading group(P＜0.01).In addition,the expression of 5α-hydroxylase(TH5α),taxane 7β-hydroxylase(7β)and taxane 14β-hydroxylase(14OH)gene were also significantly affected by irradiation.Compared with the blank group,the expression of 7β and 14OH genes was negatively correlated with shading time at 70%shading,while the trend of 50%and 90%shading was not obvious and it was presumed that 7β and 14OH gene in the taxane synthesis process for the competitive relationship.[Conclusion]In this study，the preliminary results showed that light factors could affect the synthesis of secondary metabolites and the expression of related enzyme genes.Appropriate shading(70%shading)could increase the content of paclitaxel and paclitaxel content was stable shading in 3 months.

Taxus chinensis var.mairei；shading；HPLC;PCR method;paclitaxel；10-DAB III；gene expression

R282.71

1005-5509（2017）07-0556-06

10.16466/j.issn1005-5509.2017.07.002

2017-02-27）

国家中医药行业专项项目(201407002)；浙江省自然科学基金（LQ12H28003）；浙江中医药大学科研基人才专项项目（2014ZR09）

Fund projects:National scientific research project of national traditional Chinese medicine(201407002)；Zhejiang Provincial Natural Science Foundation(LQ12H28003)；Special scientific research project of Zhejiang Chinese Medical University（2014ZR09）

张春椿，E-mail：zhangchun200123@163.com