β-烯醇化酶及其mRNA在COPD下肢骨骼肌表达水平的研究

王学荣，张剑青，赵芝焕，方利洲，戴路明

（昆明医科大学第一附属医院 呼吸二科，云南 昆明 650032）

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease,COPD）不仅仅累及肺脏，它还是一种涵盖了骨骼肌萎缩和功能障碍、骨质疏松症和全身炎症反应等多系统的疾病[1]，其中骨骼肌萎缩严重影响COPD患者生活质量及预后[2]。先期的研究发现β烯醇化酶在COPD骨骼肌萎缩患者中表达明显上调[2]，而其上调的原因和意义目前尚不清楚，本研究通过检测COPD骨骼肌萎缩者及非萎缩者的股四头肌外侧肌组织β烯醇化酶及其mRNA表达水平差异，探讨COPD骨骼肌萎缩组和非萎缩组其下肢骨骼肌β烯醇化酶的表达情况。

对象与方法

一、对象 我院2012年5月－2013年3月因股骨骨折、行内固定取出术或行股骨头置换术需入住昆明医医科大学第一附属医院骨科手术诊疗且确诊为COPD的患者26例。所入选患者符合中华医学会呼吸分会慢性阻塞性肺疾病学组颁布的《慢性阻塞性肺疾病诊疗指南》（2013年修订版）诊断标准：吸入支气管扩张剂后FEV1/FVC<70%并以FEV1%预计值来评估COPD严重程度，所选病人均为COPD稳定期，在入院前三月之内无急性加重，并且排除肢体功能障碍的神经系统疾病、严重消化道疾病、近4周使用过激素及抗生素、内分泌代谢性疾病、肿瘤疾病、营养代谢异常性疾病及有智力障碍或认知障碍者。根据患者BMI、去脂肪指数（FFMI），分为COPD骨骼肌萎缩组和COPD骨骼肌非萎缩组，标准为：BMI≤21kg/m2及FFMI≤16kg/m2（男）或FFMI≤15kg/m2（女）。手术过程中直接取股四头肌。

对照组11例，为同期因骨折入住我院骨科的年龄匹配老年人，其中男6例，女5例，平均（71.0±4.0）岁；BMI（25.4±1.6）kg/m2；去脂肪指数（17.8±1.5）kg/m2；股四头肌周径（42.9±3.8）cm。在患者实施手术过程中直接于取材部位取股四头肌做样本。

本研究经我院医学伦理委员会同意，并与入选者签订知情同意书。受试者的基本资料见附表。

二、方法 1．Western blot检测β-enolase蛋白：从三组受试对象的股四头肌肌肉标本的细胞中提取总蛋白质，然后采用十二烷基硫酸钠-聚丙酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离蛋白质，蛋白质经分离后从凝胶中转移至PVDF膜上，经固定和封闭后，进行抗体杂交，先加入未标记特异性抗体（Ab1）与膜上抗原结合，再加入标记的抗抗体（Ab2）进行杂交检测，然后用辣根过氧化物酶法，即增强化学发光（ECL）检测，并利用X线胶片感光原理，记录结果。

2．荧光定量RT-PCR检测β-enolasem RNA水平：我们从三组研究对象的股四头肌肌肉标本的细胞中，提取总RNA，然后进行cDNA合成，通过GenBank基因数据库搜索下列β-烯醇化酶基因完整mRNA序列，用BLAST分析寻找特异性最好的一段设计引物，引物设计软件为primer 5.0，引物序列（5'-3）'：F:TCCTTGGCTTACCTGACCTCTT，R:TCCACGGACCCCCTTTTATA。然后通过合理的实时定量荧光PCR技术，在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，通过Ct值（预循环数）对模板进行相对定量。

附表 3组受试对象基本资料

三、统计学处理 采用SPSS19.0软件包对数据进行统计处理，数据用（±s）表示。2组均数比较用独立样本均数t检验（independent samplet tes）t，多组均数比较应用单因素方差分析（one way ANOVA），对于不满足于方差分析条件的（方差不齐时），使用非参数检验H检验，组间比较以算出P值，Bonferroni法调整检验水平，再行比较。

结 果

一、β烯醇化酶Western blot蛋白检测结果

对照组β-烯醇化酶表达相对比例为（1.000±0.072），COPD骨骼肌非萎缩组β-烯醇化酶表达相对比例为（1.03±0.075），COPD骨骼肌萎缩组β-烯醇化酶表达相对比例为（1.200±0.078）。三组中β-烯醇化酶蛋白表达具有差异性（F=10.4，P＜0.05），进一步两两比较，各组间差异均有统计学意义，COPD骨骼肌萎缩组中β-烯醇化酶蛋白表达明显高于COPD骨骼肌非萎缩组、对照组，COPD骨骼肌非萎缩组β-烯醇化酶蛋白表达高于对照组。对照组与COPD骨骼肌非萎缩组P值=0.0005，对照组与COPD骨骼肌萎缩组P值0.0001，COPD骨骼肌非萎缩组与COPD骨骼肌萎缩组P值=0.0001。Western blot见图1。

COPD骨骼肌萎缩组与正常对照组中β-烯醇化酶蛋白表达具有差异性（P＜0.05）

二、β-烯醇化酶mRNA荧光定量PCR结果

COPD骨骼肌萎缩组、COPD骨骼肌非萎缩组、正常对照组患者股四头肌β-烯醇化酶mRNA表达具有差异性（F=7.98，P＜0.05），进一步两两比较，各组间差异均有统计学意义，COPD骨骼肌萎缩组中β-烯醇化酶mRNA表达明显高于COPD骨骼肌非萎缩组、正常对照组，COPD骨骼肌非萎缩组β-烯醇化酶mRNA表达高于正常对照组。对照组与COPD骨骼肌非萎缩组P值=0.087，对照组与COPD骨骼肌萎缩组P值=0.001，COPD骨骼肌非萎缩组与COPD骨骼肌萎缩组P值=0.0001，见图2。

三、COPD骨骼肌萎缩组及非萎缩组中β-烯醇化酶蛋白浓度及β-烯醇化酶mRNA表达水平一致升高，有一定的正相关性，COPD骨骼肌萎缩组β-烯醇化酶蛋白及β-烯醇化酶mRNA相关性分析（R=0.6312、P=0.0029），COPD骨骼肌非萎缩组β-烯醇化酶蛋白及β-烯醇化酶mRNA相关性分析（R=0.5624、P=0.0058）。

讨 论

图1 Western Blot实验结果

图2 mRNA荧光定量PCR扩增曲线

COPD骨骼肌萎缩的发生是一种多因素、多种分子生物学机制共同参与的复杂过程，其中包括缺氧、氧化应激、高碳酸血症、营养不良、局部或者系统性炎症、蛋白质合成与降解失衡、遗传易感性、日常活动减少等多种因素。在病理状态下，COPD患者肌纤维降解和合成失衡，从而出现肌纤维类型及氧化表型改变，导致骨骼肌功能障碍。β-烯醇化酶可能也参与了COPD骨骼肌功能障碍的发病机制[3]。

β-enolase主要分布于骨骼肌和心脏（横纹肌）的肌细胞内，是肌肉特异性烯醇化酶（MSE）；烯醇化酶是一种多功能蛋白，其多样性主要体现在细胞定位和功能上[4]。

本研究结果显示，COPD骨骼肌萎缩组及非萎缩组患者股四头肌β-烯醇化酶及mRNA较正常组高，其原因较为复杂，首先，β-烯醇化酶是一个关键的糖酵解酶，可通过参与调节能量代谢来满足细胞生长所需能量。COPD存在缺氧，机体可通过代偿增加糖酵解酶的表达和葡萄糖载体的生成，以增加细胞对缺氧的代谢适应[5]。其次，在COPD患者骨骼肌中存在的复杂病理因素也有可能影响动态的β-烯醇化酶的清除，造成β-烯醇化酶的相对堆积。这种升高的内在机制可能是COPD的病理过程的某些因素直接或间接作用于DNA上游调控区启动基因，使β-烯醇化酶及mRNA表达增高。

进一步分析发现，COPD骨骼肌萎缩组和非萎缩组中β-烯醇化酶都随β-烯醇化酶mRNA表达量的增加而增加，有一定的正相关性，通过增加β-烯醇化酶mRNA的量而使β-烯醇化酶增加，可能与COPD病理过程的某些因素启动DNA上游调控区启动基因增加mRNA表达量有关。但COPD骨骼肌萎缩组和非萎缩组β-烯醇化酶及β-烯醇化酶mRNA表达量存在差异，在COPD萎缩组骨骼肌β-烯醇化酶mRNA保有量相对较多，β-烯醇化酶保有量相对较少，可能与转录水平上调、翻译水平下降，同时还可能与COPD骨骼肌萎缩组患者蛋白消耗有关。在COPD非萎缩组骨骼肌β-烯醇化酶mRNA保有量（即实际应该的产生量，除去受某些因素影响而减少或增加的量）相对较少，β-烯醇化酶保有量相对较多，可能与转录下调、β-烯醇化酶mRNA寿命缩短、降解加快、翻译加速有关。提示可能不同的病理、遗传因素和调控机制在COPD骨骼肌萎缩组和非萎缩组对β-烯醇化酶的上调发挥了不同作用。

β-烯醇化酶在COPD患者中表达明显增加，且在COPD萎缩组及非萎缩组中表达水平不同，可能与上游DNA、mRNA调控机制不同有关。这种复杂的调控机制尚不明确，需要进一步研究。此外β-烯醇化酶在COPD患者骨骼肌萎缩的作用如何，也值得深入探讨。

［1］DECRAMERM,RENNARDS,TROOSTERST,et al.COPD as a lung disease with systemic consequences-clinical impact,mechanisms,and potential for early intervention[J]．COPD,2008,5(4):235-256.

［2］MADOR MJ.Musclemass,not body weight,predictsoutcome in patients with chronic obstructive pulmonary disease[J]．Am JRespir Crit Care Med,2002,166(6):787-789.

［3］郭巍,傅炜萍,杨玉,等.慢性阻塞性肺疾病患者外周骨骼肌萎缩蛋白质组初步分析[J]．中华医学杂志,2012,92(14):948-951.

［4］PANCHOLI V.Multifunctional alpha-enolase:its role in diseases[J]．Cell Mol Life Sci,2001,58(7):902-920.

［5］KIM JW,ZELLERKI,WANGY,et al.Evaluation of myc E-box phylogenetic footprints in glycolytic genes by chromatin immunoprecipitation assays[J]．Mol Cell Biol,2004,24(13):5923-5936.

［6］GOSKERHR,VANMH,VANDPJ,et al.Skeletal muscle fibre-type shifting and metabolic profile in patients with chronic obstructive pulmonary disease[J]．Eur Respir J,2002,19(4):617-625.