龟鹿二仙胶含药血清干预大鼠T细胞化疗后自噬的初步研究

陆金华钟亚珍王珏林胜友

1.杭州市第一人民医院集团杭州市肿瘤医院 杭州 310002 2.浙江中医药大学附属中山医院

龟鹿二仙胶含药血清干预大鼠T细胞化疗后自噬的初步研究

陆金华1钟亚珍1王珏2林胜友1

1.杭州市第一人民医院集团杭州市肿瘤医院 杭州 310002 2.浙江中医药大学附属中山医院

[目的]初步研究龟鹿二仙胶含药血清干预大鼠T细胞化疗后自噬的机制。[方法]将大鼠T细胞分为空白对照组、顺铂组、中药血清组、顺铂+中药血清组，干预12h、24h后使用RT-PCR、Western Blot技术检测各组细胞ATG5、ClassIII PI3K、ClassI PI3K、mTOR mRNA及蛋白的表达情况。[结果]干预12h后，RT-PCR结果显示，与空白对照组比较，顺铂组ATG5、ClassⅢ PI3K、ClassⅠPI3K、mTOR mRNA表达上升，差异有统计学意义（P＜0.01）。中药血清组ATG5、ClassⅢ PI3K、mTOR mRNA表达下调，差异有统计学意义（P＜0.01）。与顺铂组比较，顺铂+中药血清组ATG5、ClassⅢPI3K、ClassⅠPI3K、mTOR mRNA表达均下降，差异有统计学意义（P＜0.01）。Western Blot结果显示，顺铂组mTOR蛋白表达较空白对照组上升（P＜0.05），其余组别各蛋白变化不明显（P＞0.05）。干预 24h 后，RT-PCR 结果显示，与空白对照组比较，顺铂组 ATG5、ClassⅢ PI3K、ClassⅠPI3K、mTOR mRNA表达上升，差异有统计学意义(P＜0.01)；中药血清组ATG5 mRNA表达下降，差异有统计学意义(P＜0.01)，ClassⅢ PI3K、mTOR mRNA表达上升，差异有统计学意义（P＜0.05）；与顺铂组比较，顺铂+中药血清组ATG5、ClassⅢ PI3K、ClassⅠPI3K、mTOR mRNA表达下降，差异有统计学意义（P＜0.01）。Western Blot结果显示，顺铂+中药血清组 ATG5、ClassⅢ PI3K 蛋白表达较顺铂组下降（P＜0.05），ClassⅠPI3K、mTOR 蛋白变化不明显（P＞0.05）。[结论]龟鹿二仙胶含药血清对大鼠T细胞化疗后自噬蛋白ATG5、ClassⅢPI3K、ClassⅠPI3K、mTOR的表达具有一定的调节作用。

龟鹿二仙胶；T 细胞；ATG5；ClassⅢ PI3K；ClassⅠPI3K；mTOR；自噬；化疗

T细胞介导的细胞免疫是肿瘤免疫的重要方式之一[1]，化疗后T细胞介导的细胞免疫功能受损是影响肿瘤患者预后的重要原因之一，故保护化疗后患者的T细胞数量及功能是肿瘤治疗和改善预后研究的重要任务之一。项目团队既往研究发现，龟鹿二仙胶能抑制化疗后小鼠脾脏T淋巴细胞的凋亡[2]，国内外研究显示，细胞凋亡与细胞的自噬过程存在密不可分的关系[3]，故本文着重研究龟鹿二仙胶含药血清影响化疗后大鼠T淋巴细胞自噬的机制。

1 材料与方法

1.1 药品 龟鹿二仙胶（组方：龟板胶6g、鹿角胶9g、枸杞子15g、生晒参9g）的中药饮片由杭州市肿瘤医院中药房采购，由浙江中医药大学中药制剂室进行质控并制备药液。根据“人和动物之间按体表面积折算的等效剂量比值表”计算等效剂量（以生药量计算，最终浓度为1g·mL-1），4℃保存。顺铂粉剂（杭州市肿瘤医院药房，批号：1WA2A160100）。

1.2 主要试剂 1640培养基（GIBCO，批号：8116222）；大鼠脾脏淋巴细胞分离液（TBD，批号：LTS1083P）；Anti-ClassI PI3K 抗体（SANTA，批号：sc7189）；Anti-ClassIII PI3K 抗体（SANTA，批号：sc134986）；Anti-ATG5 抗体（SANTA，批号：sc33210）；Anti-mTOR 抗体（SANTA，批号：sc8319）；RNA提取试剂盒（上海捷瑞生物工程公司，批号：GK3016）；PrimeScriptTM RT Master Mix(Perfect Real Time)（TaKaRa公司，批号：RR036A）；SuperReal PreMix Color(SYBR Green)（北京天根生化科技公司，批号：FP215）。

1.3 主要仪器 3111型细胞培养箱（美国Thermo）；微量加样器（美国Thermo）；H1650R台式高速冷冻离心机（上海卢湘仪离心机仪器有限公司）；Spectra-MaxPlus 384酶标仪（美国 Molecular Devices）；Mini-Proten Tetra Syste电泳系统（美国Bio-RAD）；ChemiDoc XRS+System凝胶成像仪（美国Bio-RAD）；移液器（德国Eppendorf）；TD5A台式低速离心机（湖南凯达实业公司）；TU-10恒温金属浴（上海一恒仪器公司）；SMA4000微光分光光度计（美国 Merinton）；CFX Connect Real-Time System(96孔)定量PCR仪（美国BIO-RAD）。

1.4 实验动物 SPF级SD大鼠，雄性，体质量（200±20）g，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，生产许可证号：SCXK(沪)2012-0002，动物质量合格证号：0234779。动物饲养在杭州赫贝科技有限公司的实验动物房，使用许可证号：SYXK(浙)2015-0008。饲养环境：温度范围20～25℃，相对湿度范围40%～70%。

1.5 含药血清的制备 SD大鼠12只，龟鹿二仙胶药液灌胃，1次/d，每次2mL，连续3d，末次灌胃1h后进行腹主动脉取血，离心后收集血清，水浴灭活，过滤，-20℃保存。

1.6 大鼠T淋巴细胞悬液的制备 SD大鼠2只，无菌条件下取脾脏，剪至5×5mm小块，载玻片研碎，制成脾脏细胞悬液，200目过筛，收集单细胞悬液，320g离心5min，PBS重悬，滴加到等体积的淋巴细胞分离液中，510g水平离心20min，收取淋巴细胞层，细胞洗涤液清洗（5倍体积），320g离心5min，收集淋巴细胞沉淀，10%FBS 1640培养基重悬，即为T淋巴细胞悬液。

1.7 分组及细胞给药处理 取T淋巴细胞悬液，调整细胞数密度至1×107/mL，以每孔100μL加入96孔细胞培养板，分为空白对照组（10%FBS1640培养基）、中药血清组（4%大鼠正常血清+6%含药血清1640培养基）、顺铂组（40μmoL顺铂+10%FBS1640培养基）、顺铂+中药血清组（40μmoL顺铂+4%大鼠正常血清+6%含药血清1640培养基）。将96孔板置于37℃、5%CO2培养箱培养12h后，弃上清液，加入100μL对应的培养基继续培养，分别选取12h、24h两个时间点进行检测。

1.8 RT-PCR检测自噬相关蛋白mRNA表达 提取总RNA，经反转录成cDNA，设定GAPDH为内参，RT-PCR 测定ATG5、ClassⅢ PI3K、ClassⅠPI3K、mTOR mRNA的表达。ATG5引物序列，正向：5’-TGCTCACTGGATGGAACCAC-3’，反向：5’-GCCTGTCAGCGAGGTTTACT-3’；ClassⅢPI3K引物序列，正向：5’-GCCCCATTTCATCCTTGTG-3’，反向：5’-GGTTGTTGTTGCCCCAGAC-3’；ClassⅠPI3K 引物序列，正向：5’-AGAGCCACAGGTGAAAATACGG-3’，反向 ：5’-CCAGATTTTCTTTCCGCAACAG-3’；mTOR引物序列，正向：5’-TTGCCAACTACCTTCGGAACC-3’，反向：5’-TCACGGAGAACGAGGACAGC-3’。GAPDH 引物序列，正向：5’-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3’，反向：5’-CAGTGCCAGCCTCGTCTCAT-3’。反应条件为:95℃预变性 15min，95℃变性 10s，59℃退火 30s，70℃延伸 40s，40 个循环，反应结束后，记录 65～95℃范围内的熔解曲线。采用2－△△CT值分析结果。

1.9 Western Blot检测自噬相关蛋白的表达 根据样本细胞量加入100μL IP裂解液，重悬摇晃离心后提取总蛋白，BCA法测定蛋白浓度，调整蛋白浓度后按每泳道30μg进行上样、电泳、转膜、封闭、洗涤，加入目标蛋白一抗、洗涤、加入二抗，最后用ECL化学发光检测法进行显影。

1.10 统计学方法 应用SPSS13.0统计软件进行统计分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，进行正态分布检验和方差齐性检验后，采用单因素方差分析比较组间的显著性差异，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 干预12h后T细胞自噬相关蛋白mRNA的表达情况 与空白对照组比较，顺铂组ATG5、ClassⅢPI3K、ClassⅠPI3K、mTOR mRNA 表达上调，差异有统计学意义 (P＜0.01)；中药血清组ATG5、ClassⅢ PI3K、mTOR mRNA表达下调，差异有统计学意义(P＜0.01)；顺铂+中药血清组 ATG5、ClassⅢ PI3K、ClassⅠPI3K、mTOR mRNA表达均下降，差异有统计学意义（P＜0.01）。与顺铂组比较，顺铂+中药血清组ATG5、ClassⅢ PI3K、ClassⅠPI3K、mTOR mRNA 表达均下降，差异有统计学意义（P＜0.01）。见表1。

2.2 干预24h后T细胞自噬相关蛋白mRNA的表达情况 与空白对照组比较，顺铂组ATG5、ClassⅢPI3K、ClassⅠPI3K、mTOR mRNA 表达上升，差异有统计学意义(P＜0.01)；中药血清组ATG5 mRNA表达下降，差异有统计学意义（P＜0.01），ClassⅢ PI3K、mTOR mRNA表达上升，差异有统计学意义(P＜0.05)；顺铂+中药血清组ATG5、ClassⅢ PI3K、ClassⅠPI3K表达下降，差异有统计学意义（P＜0.01）。与顺铂组比较，顺铂+中药血清组ATG5、ClassⅢ PI3K、ClassⅠPI3K、mTOR mRNA表达下降，差异有统计学意义（P＜0.01）。见表 2。

表1 干预12h后T细胞自噬相关蛋白mRNA的表达情况(±s,n=3)Tab.1 Changes of Autophagy associated Proteins mRNA in T cell after 12h(±s,n=3)

表1 干预12h后T细胞自噬相关蛋白mRNA的表达情况(±s,n=3)Tab.1 Changes of Autophagy associated Proteins mRNA in T cell after 12h(±s,n=3)

注：与空白对照组比较，★★P＜0.01；与顺铂组比较，△△P＜0.01。Note：Compared with blank control group,★★P＜0.01；compared with DDP group,△△P＜0.01.

组别 ATG5 ClassⅢ PI3K ClassⅠPI3K mTOR空白对照组顺铂组中药血清组顺铂+中药血清组1.00±0.00 1.76±0.02★★0.74±0.02★★1.26±0.04★★△△1.00±0.00 1.33±0.03★★0.67±0.04★★1.22±0.03★★△△1.00±0.00 3.46±0.01★★0.88±0.02★★3.42±0.01★★△△1.00±0.00 2.75±0.07★★0.91±0.02 2.45±0.11★★△△

2.3 干预12h后T细胞自噬相关蛋白表达情况 与空白对照组比较，顺铂组mTOR表达上升，差异有统计学意义 （P＜0.05），ATG5、Class Ⅲ PI3K、ClassⅠPI3K表达呈现上升趋势，但差异无统计学意义（P＞0.05），中药血清组ATG5表达呈现下降趋势，ClassⅢPI3K、ClassⅠPI3K、mTOR mRNA表达稍呈现上升趋势，但差异无统计学意义（P＞0.05）。与顺铂组比较，顺铂+中药血清组 ATG5、ClassⅢ PI3K、ClassⅠPI3K、mTOR表达未见明显下降，差异无统计学意义（P＞0.05）。见图 1、2。

表2 干预24h后T细胞自噬相关蛋白mRNA的表达情况(±s,n=3)Tab.2 Changes of Autophagy associated Proteins mRNA in Tcell after 24h(±s,n=3)

表2 干预24h后T细胞自噬相关蛋白mRNA的表达情况(±s,n=3)Tab.2 Changes of Autophagy associated Proteins mRNA in Tcell after 24h(±s,n=3)

注：与空白对照组比较，★P＜0.05，★★P＜0.01；与顺铂组比较，△△P＜0.01。Note：Compared with blank control group,★P＜0.05,★★P＜0.01；compared with DDP group,△△P＜0.01.

组别 ATG5 ClassⅢ PI3K ClassⅠPI3K mTOR空白对照组顺铂组中药血清组顺铂+中药血清组1.00±0.00 2.75±0.14★★0.85±0.02★★0.95±0.01★★△△1.00±0.00 3.24±0.11★★1.16±0.05★0.61±0.03★★△△1.00±0.00 2.31±0.17★★0.86±0.01 0.71±0.02★★△△1.00±0.00 4.05±0.18★★1.21±0.02★0.87±0.05△△

图1 干预12h后各组自噬相关蛋白条带图Fig.1 Bands of autophagy associated proteins in T cell after 12h

图2 干预12h后各组自噬相关蛋白表达情况Fig.2 Changes of autophagy associated proteins in T cell after 12h

2.4 干预24h后T细胞自噬相关蛋白表达情况 与空白对照组比较，顺铂组ATG5、ClassⅢ PI3K、ClassⅠPI3K、mTOR表达呈现上升趋势，但差异均无统计学意义（P＞0.05）；中药血清组 ATG5、ClassⅢ PI3K、ClassⅠPI3K、mTOR表达呈现下降趋势，但差异也均无统计学意义（P＞0.05）。与顺铂组比较，顺铂+中药血清组ATG5、ClassⅢ PI3K表达下降，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图 3、4。

图3 干预24h后各组自噬相关蛋白条带图Fig.3 Bands of autophagy associated proteins in T cell after 24h

图4 干预24h后各组自噬相关蛋白表达情况Fig.4 Changes of autophagy associated proteins in T cell after 24h

3 讨论

多次化疗后的肿瘤患者常出现乏力、纳差、气短、畏寒肢冷、腰膝酸软等症状，属肺、脾、肾三脏亏虚征象。文献大多提示采用益气滋阴补阳类中药进行“扶正”治疗。本研究选用的龟鹿二仙胶出自明代王三才《医便》一书，由鹿角胶、龟板胶、人参、枸杞子四味滋味纯厚的药品组成，是中医传统名方。《古今名医方论》云“龟得天地之阴气最厚，善通任脉”，能滋阴补血潜阳；“鹿得天地之阳气最全，善通督脉”，能补肾益精。《医方考》云“人参善于固气，枸杞子善于滋阴”；四药合用，益精生血、阴阳并补，成为各科治疗虚症的基本方。在现代临床实践中，龟鹿二仙胶被广泛用于衰老、慢性疲劳综合征、骨质疏松症、老年痴呆、生殖系统异常等多种疾病。本项目团队先前研究证实龟鹿二仙胶可以有效抑制化疗后小鼠脾脏T淋巴细胞、CD34+造血干/祖细胞的凋亡，减轻化疗后免疫功能受损，促进骨髓造血[2]。后开展龟鹿二仙胶巴布剂的临床研究，在Ⅲ～Ⅳ期结直肠癌患者化疗期间辅助运用龟鹿二仙胶巴布剂，能减轻患者化疗后的白细胞、中性粒细胞减少等骨髓抑制状态，改善中医症状积分，从而提高患者的生存质量[4-5]。近来，本项目团队对龟鹿二仙胶促进骨髓造血及减轻免疫功能受损展开了进一步研究。前期研究显示化疗后大鼠T淋巴细胞活力下降、凋亡增多，细胞内自噬体（Autophagyosome）、自噬溶酶体（Autolysosome）明显增多，龟鹿二仙胶含药血清干预后，大鼠T淋巴细胞活力增加，凋亡减少，细胞内自噬体、自噬溶酶体数量减少，提示龟鹿二仙胶能有效抑制化疗后大鼠脾脏T淋巴细胞的凋亡。

普遍认为自噬是一种细胞的防御和应激调控机制，对细胞在恶劣环境下的生存具有重要意义。以细胞浆内自噬体、自噬溶酶体的形成为主要特征[6]，大致由五个关键阶段构成[7]：（1）形成吞噬泡；（2）ATG5-12复合物形成与ATG16多聚化；（3）LC3形成并插入吞噬泡膜；（4）包绕预被降解物；（5）自噬体与溶酶体融合。其中ATG5与ATG12形成的复合物是自噬体形成的必要条件。自噬过程受多条上游信号通路调控，比较肯定的有[8-10]：Class I PI3K/AKT/mTOR负调节信号途径；Class III PI3K正调节信号途径。Class I PI3K及mTOR是自噬发生的上游负调节信号通路中的关键蛋白，表达上升可能会抑制自噬发生；Class III PI3K是自噬发生的上游正调节途径的关键蛋白，其表达上升可能会促进自噬发生。ATG5是自噬体形成的关键组分蛋白，其表达上升提示自噬体形成增加。

研究小组选择自噬过程的关键蛋白及上游分子作为研究对象，研究显示：干预12h后，顺铂组ATG5、Class III PI3K、ClassⅠPI3K、mTOR mRNA 表达较空白对照组上调（P＜0.01）；顺铂+中药血清组ATG5、Class III PI3K、ClassⅠPI3K、mTOR mRNA 表达较顺铂组下降（P＜0.01）。顺铂组mTOR蛋白表达较空白对照组上升（P＜0.05），其余组别各蛋白变化不明显（P＞0.05）。干预 24h后，顺铂组 ATG5、Class III PI3K、ClassⅠPI3K、mTOR mRNA表达较空白对照组上升（P＜0.01）；顺铂+中药血清组ATG5、ClassIII PI3K、ClassⅠPI3K、mTOR mRNA 表达较顺铂组下降（P＜0.01）。ATG5、ClassIII PI3K 蛋白表达较顺铂组下降（P＜0.05），与mRNA一致，而ClassⅠPI3K、mTOR蛋白变化不明显。mRNA与蛋白表达的差异可能与中药的多靶点性，以及基因表达翻译为蛋白的时效差异有关。结果显示顺铂能够上调自噬上游负调节通路中关键蛋白ClassⅠPI3K、mTOR的表达，上调正调节通路蛋白ClassIII PI3K的表达，上调自噬体形成关键蛋白ATG5的表达，提示顺铂对T细胞自噬过程具有干预作用，并且对自噬体形成的上游正负调节通路均有促进作用。但最终表现为自噬体形成蛋白ATG5的上升，提示顺铂对自噬过程影响以促进作用为主。而中药血清能下调上述蛋白的表达，提示中药血清对顺铂导致的T细胞自噬具有抑制作用。

综上所述，龟鹿二仙胶含药血清对化疗后T细胞自噬过程具有干预作用，并且可能主要作用于正调节通路及自噬体的形成过程。本研究为龟鹿二仙胶对抗化疗后免疫抑制的临床运用提供了理论依据。

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Study on the Mechanism of Autophagy after Intervention of Guiluerxianjiao Decoction Drug Serum of Rat T Cell

LU Jinhua1,ZHONG Yazhen1,WANG Jue2,et al 1．Hangzhou Cancer Hospital/Hangzhou First People’s Hospital，Zhejiang(310002)，China;2．Third Affiliated Hospital of Zhejiang Chinese Medical University

[Objective]To investigate the effects of Guiluerxianjiao decoction drug serum on the autophagy associated proteins of T cell(rat).discuss the internal mechansim of Guiluerxianjiao decoction drug serum on autophagy related signaling pathway in T cell after chemotherapy.[Method]The T cells were divided into 4 groups,i.e.,the blank control group,the DDP group,the Guiluerxianjiao decoction drug serum group,the DDP+Guiluerxianjiao decoction drug serum group.The autophagy associated proteins were detected by RT-PCR and Western Blot after 12h and 24h.[Results]After 12h，RT-PCR showed that compared with the blank control group,the expression of ATG5,ClassIII PI3K,ClassI PI3K,mTOR mRNA was increased(P＜0.01)after intervention of Cisplatin;and the expression of ATG5,ClassIII PI3K,mTOR mRNA was decreased(P＜0.01)after intervention of Guiluerxianjiao decoction drug serum.Compared with the DDP group,and the expression of ATG5,ClassIII PI3K,ClassI PI3K and mTOR mRNA was decreased in the DDP+Guiluerxianjiao decoction drug serum group(P＜0.01).Western Blot showed that only the expression of mTOR protein was increased in the DDP group compared with the blank control group(P＜0.05).The proteins in other groups had no significant change(P＞0.05).After 24h，RT-PCR showed that compared with the blank control group,the expression of ATG5,ClassIII PI3K,ClassI PI3K,mTOR mRNA was increased(P＜0.01)after intervention of Cisplatin;and the expression of ATG5 was decreased(P＜0.01)，ClassIII PI3K,mTOR mRNA was increased(P＜0.05)after intervention of Guiluerxianjiao decotion drug serum.Compared with the DDP group,and the expression of ATG5,ClassIII PI3K,ClassI PI3K and mTOR mRNA was decreased in the DDP+Guiluerxianjiao decoction drug serum group(P＜0.01).Western Blot showed that the expression of ATG5 and ClassIII PI3K protein was decreased in the DDP+Guiluerxianjiao decoction drug serum group compared with the DDP group（P＜0.05）.The ClassⅠPI3K and mTOR proteins had no significant change（P＞0.05）.[Conclusion]Guiluerxianjiao Decoction drug serum can regulate the expression of ATG5,ClassIII PI3K,ClassI PI3K,mTOR.

Guiluerxianjiao Decoction；T cell；ATG5；ClassⅢ PI3K；ClassⅠPI3K；mTOR；autophagy；chemotherapy

R331

A

1005-5509（2017）07-0612-05

10.16466/j.issn1005-5509.2017.07.015

2017-01-09）

浙江省医药卫生科研项目（2014KYB202）；杭州市卫生科技计划（2014A32）

Fund projects：Projectofmedicaland health technology developmentprogram in Zhejiang Province （2014KYB202）；Science and Technology Planning Project of Hangzhou（2014A32）

林胜友，E-mail：linsy0628@163.com