桔梗皂甙D对人胃癌细胞SGC7901增殖的抑制作用和机制研究

代群 黄宣 陈喆

浙江中医药大学附属第一医院 杭州 310006

桔梗皂甙D对人胃癌细胞SGC7901增殖的抑制作用和机制研究

代群 黄宣 陈喆

浙江中医药大学附属第一医院 杭州 310006

[目的]探讨桔梗皂甙D（platycodin D，PD）对人胃癌细胞株SGC7901增殖的抑制作用及作用机制。[方法]体外培养人胃癌细胞株SGC7901，加入终浓度分别为5～20μm·L-1的PD。采用MTT法测定药物对细胞增殖的抑制作用，Annexin V/PI双标法检测细胞凋亡率，JC-1检测线粒体膜电位的变化，Western blot检测PD对凋亡相关蛋白cleaved caspase-3、cleaved caspase-9、cleaved PARP、bcl-2、bax和对MAPK信号通路蛋白ERK、JNK、p38及其磷酸化蛋白p-ERK、p-JNK、p-p38表达的影响。[结果]MTT结果显示，PD作用24h和48h后，PD对SGC7901细胞增殖的抑制随浓度的增加而增强；PD作用SGC7901后，细胞凋亡率明显增加，线粒体膜电位降低。Western blot检测结果显示cleaved PARP、cleaved caspase-3、cleaved caspase-9、bax蛋白表达量随着药物浓度的增加而升高，bcl-2蛋白表达下降，同时p-JNK、p-p38水平明显升高，p-ERK蛋白水平下降，ERK、JNK、p38蛋白的表达无明显变化。[结论]PD对胃癌细胞SGC7901有抑制增殖和诱导凋亡的作用。PD通过抑制ERK信号通路从而抑制细胞增殖，通过激活JNK和p38信号途径调控bax和bcl-2表达，导致线粒体膜电位下降，进而激活caspase，诱导癌细胞凋亡的发生。

PD；SGC7901；细胞凋亡；线粒体膜电位；bcl-2家族蛋白；MAPK信号通路

胃癌是国内发病率和死亡率较高的恶性肿瘤之一，从分子肿瘤学角度分析，胃癌的发病机制在于肿瘤细胞增殖和凋亡的调控。近年来中药抗肿瘤研究取得很大进展。桔梗皂苷D（platycodin，PD）是从桔梗中提取的主要活性成分，对多种肿瘤细胞如肺癌[1]、卵巢癌[2]、乳腺癌[3]、前列腺癌[4]等具有抑制增殖和诱导凋亡的作用。PD抗肿瘤活性涉及抑制肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤血管生成、抑制肿瘤细胞侵袭与转移[1-4]。丝裂原激活蛋白激酶（mitogenactivated protein kinase,MAPK）信号传导途径，可将细胞外信息传递至细胞核中，介导细胞的生存和凋亡，研究证实该信号通路异常与肿瘤发生、发展关系密切[5]。MAPK信号转导途径包括ERK、JNK和p38信号通路，其中ERK信号通路主要与细胞的增殖相关[6]，JNK和p38信号通路则主要介导细胞的炎症和凋亡[7-8]。本研究拟探讨PD对人胃癌细胞株SGC7901增殖的抑制作用，及其否通过调控MAPK信号转导通路发挥抗肿瘤的功效。

1 材料与方法

1.1 材料 PD购自成都曼思特生物科技有限公司(纯度＞98%)；胎牛血清购自 Giboc 公司（1227693）；RPMI1640培养液培养基购自科易生物技术有限公司（2016011603）；CCK-8 试剂购自 Dojindo（KM671）；Apoptosis Assay细胞凋亡试剂盒（5306537）和JC-1线粒体膜电位检测试剂盒（71926）均购自BD公司；抗体 p-JNK(9255)、JNK(9258)、p-38(9215)、p38(9217)、p-ERK(9101)、ERK(9102)、bax(2772S)、bcl-2(2870)、cleaved PARP(9542S)、cleaved caspase-3(9661S)、cleaved caspase-9（9505S）均购自 Cell Signal公司；β-actin（4970P）及抗兔和抗鼠的二抗均为Santa Cruz公司产品。

1.2 细胞株及细胞培养 人胃癌细胞株SGC7901购自中科院上海细胞生物研究所，含10%胎牛血清的RPMI1640培养液培养，置于37℃、5%CO2恒温培养箱中。

1.3 实验方法

1.3.1 细胞增殖抑制实验 收集对数生长期的SGC7901细胞，以5×104/mL接种于96孔培养板中，每孔 100μL，加入终浓度为 5、10、15、20μm·L-1的PD，每个浓度设平行孔6个，并设立不加PD的空白组作为对照，于37℃,5%CO2培养箱中继续培养24、48h后，每孔加入10μL CCK-8溶液，继续培养箱内孵育4h，酶标仪450nm处检测OD值，根据OD值计算药物体外生长抑制率（inhibition rates，IR）和细胞存活率。

1.3.2 细胞凋亡实验 取对数生长期的SGC7901细胞，按以5×104/mL接种于6孔板，每孔1mL。分别收集 5、10、15、20μm·L-1PD 药物作用 24h 的细胞以及不加PD药物的空白组细胞。按试剂盒说明书进行操作，冷PBS缓冲液洗2次，重悬于1×结合缓冲液，调整细胞密度为1×106/L。取100μL细胞悬液加5μL Annexin-V FITC 标记液和 5μL PI(50μm·mL-1)混匀，室温避光孵育15min后，加400μL结合缓冲液，流式细胞仪检测，分析细胞凋亡的百分比。

1.3.3 线粒体膜电位的测定PD作用SGC7901细胞24h，收集细胞，PBS洗细胞3次，用去离子水按1:9比例稀释 10×incubation Buffer为 1×incubation Buffer，混匀并预热至 37℃，吸取 2.5mL 1×incubation Buffer，加入5μL JC-1 stocking solution，涡旋混匀配成JC-1 working solution，取 500μL JC-1 working solution将细胞均匀悬浮，37℃、5%CO2的培养箱中孵育15min，室温离心收集细胞，用 1×incubation Buffer洗两次，吸取500μL 1×incubation Buffer重新悬浮细胞，流式细胞仪检测线粒体膜电位。

1.3.4 Western-Blot检测蛋白表达 收集不同浓度PD作用24h的细胞，PBS洗涤2次，加入细胞裂解液100μL，12000r/min离心15min，采用BCA方法测定蛋白浓度，取30μg蛋白，加入上样缓冲液，100℃下变性10min。10%的聚丙烯酰胺SDS凝胶电泳后，电转移至PVDF膜上，5%脱脂牛奶封闭后依次加入第一、二抗体，在室温下孵育2h，TBST缓冲液洗涤3次，每次10min，过氧化物酶法显色，凝胶显微成像系统处理，采用Quantity one软件分析结果。

1.4 统计学方法 采用SPSS17.0进行统计，各组数据采用±s表示，两组间数据比较用t检验，P＜0.05为差异有统计意义。

2 结果

2.1 PD对SGC7901细胞的增殖抑制作用 5、10、15、20μm·L-1浓度的 PD 处理 SGC7901细胞 24h和48h，PD对细胞增殖的抑制作用（表1），细胞存活率（图1）。结果显示PD对胃癌细胞SGC7901的抑制作用呈现明显的剂量效应关系，差异有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01）。

表1 PD对SGC7901细胞增殖的抑制作用（%，±s，n=3）Tab.1 Inhibitory effect of PD on the proliferation of SGC7901（%，±s，n=3）

表1 PD对SGC7901细胞增殖的抑制作用（%，±s，n=3）Tab.1 Inhibitory effect of PD on the proliferation of SGC7901（%，±s，n=3）

注：与空白组比较，*P＜0.05,**P＜0.01。Note:Compared with the blank group*P＜0.05,**P＜0.01.

时间40.2±7.6**59.8±10.3**10 15 20 24h 48h PD（μm·L-1）0 5 0 0 6.8±3.4 11.6±5.4 15.3±8.2*26.8±6.3*35.2±9.5**49.6±9.4**

图1 PD对胃癌细胞SGC7901增殖存活率的影响Fig.1 Effect of PD on survival rate of gastric cancer cell SGC7901proliferation

2.2 PD诱导SGC7901细胞凋亡的作用 收集不同浓度PD处理24h的SGC7901细胞细胞，并用AnnexinV FITC/PI试剂标记，5、10、15、20μm·L-1PD诱导细胞的早期凋亡率分别为（8.3±3.6）%、（15.9±4.2）%、（31.2±5.3）%、（39.6±5.2）%，与空白组凋亡率（2.5±1.2）%相比，细胞凋亡率明显增加，见图 2A；10、15、20μm·L-1PD与空白组比较差异有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01），见图 2B。

2.3 PD对SGC7901细胞线粒体膜电位的影响 SGC7901细胞经 5、10、15、20μm·L-1PD 作用 24h 后，线粒体膜电位分别是 （87.6±4.9）%、（82.7±6.8）%、（56.7±5.7）%和（36.4±6.3）%，与空白组线粒体膜电位（94.2±1.8）%比较，结果显示随PD浓度的增加，线粒体膜电位降低，见图 3A；10、15、20μm·L-1PD 与空白组比较差异有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01），见图 3B。

图2 A PD诱导SGC7901细胞凋亡的作用Fig.2A The effect of PD on apoptosis of SGC7901

图2 B PD诱导细胞凋亡率的统计分析Fig.2B Statistical analysis of PD on apoptosis rate

图3 A PD对SGC7901细胞线粒体膜电位的影响Fig.3A Effects of PD on mitochondrial membrane potential of SGC7901

图3 B PD对细胞线粒体膜电位的统计分析Fig.3B Statistical analysis of PD on mitochondrial membrane potential

2.4 PD对caspase相关蛋白的影响 Western-blot实验结果显示PD作用SGC7901细胞24h后，随着药物浓度增加，cleaved PARP、cleaved caspase-3、cleaved caspase-9蛋白浓度逐渐增加，（图4A）。半定量分析结果显示随着药物浓度的增高，PD对cleaved PARP、cleaved caspase-3、cleaved caspase-9 蛋白的作用逐渐增强，15和20μm·L-1浓度的PD与空白组比较，差异有统计学意义（P＜0.05），（图 4B）。结果表明PD可以活化 caspase-3和caspase-9蛋白酶，形成cleaved caspase-3和cleaved caspase-9，进而降解底物生成cleaved PARP，参与细胞凋亡的发生。

2.5 PD对SGC7901细胞bcl-2和bax蛋白表达的影响 不同浓度的PD作用SGC7901细胞24h后，Western blot方法检测结果显示bax蛋白表达水平随药物浓度的增加而增加，而bcl-2蛋白表达水平逐渐降低，（图5A）。半定量分析结果显示随着药物浓度的增高，PD对bax、bcl-2蛋白的作用逐渐增强，15和20μm·L-1浓度的PD与空白组比较，差异有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01），（图 5B）。结果表明 PD 可以作用bcl家族蛋白诱导细胞凋亡的发生。

2.6 PD对MAPK信号通路关键蛋白的作用 PD处理SGC7901细胞24h，Western blot方法检测结果显示p-JNK和p-p38增加，JNK、p38蛋白表达变化不明显，表明PD激活了JNK、p38信号转导通路。p-JNK和p-p38升高的同时，p-ERK表达下降，表明PD通过降低ERK的活性抑制SGC7901细胞的增殖，（图6A）。半定量分析结果显示随着药物浓度的增高，JNK、p38、ERK蛋白表达无明显差异，而对p-JNK、p-p38、p-ERK 蛋白的作用逐渐增强，15 和20μm·L-1浓度的PD与空白组比较，差异有统计学意义（P＜0.05），（图6B）。结果表明PD可以抑制 ERK信号，同时激活JNK和p38信号途径。

图4 A PD对SGC7901细胞caspase相关蛋白的作用Fig.4A Effects of PD on caspase protein in SGC7901 Cells

图4 B PD对caspase相关蛋白作用的半定量分析Fig.4B Semi-quantitative analysis of PD on caspase protein

图5 A PD对SGC7901细胞凋亡相关蛋白bcl-2和bax的影响Fig.5A Effects of PD on apoptosis related protein bcl-2 and bax in SGC7901 Cells

图5 B PD对bcl-2和bax蛋白的半定量分析Fig.5B Semi-quantitative analysis of PD on protein bcl-2 and bax

图6 A PD对MAPK信号通路关键蛋白的影响Fig.6A Effects of PD on important proteins of MAPK signaling pathway

图6 B PD对MAPK信号通路关键蛋白作用的半定量分析Fig.6B Semi-quantitative analysis of PD on important proteins of MAPK signaling pathway

3 讨论

PD是常用传统中药桔梗的主要活性成分之一，近年来国内外对其在体内体外研究逐渐增多。PD不仅在抗炎镇痛、调节免疫方面表现出良好的药理活性，大量文献报道PD也有抑制肿瘤细胞增殖的作用[1-4]。本研究结果显示PD对胃癌细胞株SGC7901有抑制生长的作用，呈浓度依赖性，流式检测结果也证实PD体外有诱导细胞凋亡的作用。

线粒体膜电位的破坏是细胞凋亡早期发生的一个标志性事件。bcl-2家族蛋白是重要的细胞线粒体凋亡调节因子，包括抑制和促进细胞凋亡两类功能相反的蛋白质，蛋白成员间的相互作用对线粒体介导的细胞凋亡起调控作用。抗凋亡蛋白bcl-2与结合在线粒体外膜面或存在于胞浆的促凋亡蛋白bax、bak等相互作用，引起线粒体膜通透性改变和跨膜电位丢失。细胞受到凋亡诱导后线粒体膜电位的变化使得膜的通透性发生改变。膜通透性的增加，使得线粒体蛋白包括细胞色素C、核酸内切酶、凋亡诱导因子等从线粒体基质释放到细胞浆。细胞色素C的释放伴随膜电位的完全丧失，进而引发细胞凋亡酶的级联效应。本实验应用JC-1染色，通过流式细胞仪检测线粒体膜电位的变化，发现随着药物浓度的增加，胃癌细胞线粒体膜电位逐渐下降；实验结果证实PD通过调控bcl-2、bax蛋白表达的改变引发线粒体膜电位的下降，激活caspase导致细胞凋亡。

丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPK）是细胞内的一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，将细胞外刺激信号转导至细胞及其核内，在细胞增殖、分化、转化及凋亡等的过程中具有至关重要的作用。已有文献报道PD通过激活MAPK信号通路和EGFR介导的Akt通路发挥抑制乳腺癌生长、迁移、侵袭的作用[9]；也有研究发现PD通过激活p38信号通路诱导胃腺癌ACS凋亡和线粒体凋亡[10]。MAPK信号通路包括ERK、JNK/SAPK和P38信号途径。其中ERK信号途径与细胞增殖相关，JNK/SAPK和p38信号途径通过诱导bcl-2和bax线粒体转位，调控细胞凋亡。为了深入探讨PD诱发SGC7901细胞凋亡的可能的信号转导通路，本实验检测MAPK信号途径中的关键蛋白。结果发现在PD作用下，磷酸化的JNK、p38表达升高，说明PD通过激活JNK和p38信号通路诱导胃癌细胞的凋亡。ERK的活性增强与细胞生长密切相关，随着药物浓度的增高，磷酸化的ERK表达下降，表明PD通过调控ERK蛋白活性的降低发挥抑制胃癌细胞增殖的作用。综上，PD能抑制胃癌细胞的增殖，通过抑制ERK信号通路从而抑制细胞增殖，通过激活JNK和p38信号途径调控bax和bcl-2表达，导致线粒体膜电位下降，进而激活caspase，诱导细胞凋亡。

References:

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[2] Hu Q,Pan R,Wang L,et al.Platycodon grandiflorum induces apoptosis in SKOV3 human ovarian cancer cels through mitochondrial-dependent pathway[J].Am J Chin Med,2010,38(2):373-386.

[3] Yu JS,Kim AK.Platycodin D induces apoptosisin MCF-7 human breast cancer cells[J].J Med Food,2010,13(2):298-305.

[4] Zhou R,Lu Z,Liu K,et al.Platycodin D induces tumor growth arrest by activating FOX03a expression in prostate cancer in ivitro and in vivo[J].Curr Cancer Drug Target,2015,14(9):860-871.

[5] MillerMA,Sullivan RJ,LauffenburgerDA.Molecular Pathways:Receptor Ectodomain Shedding in Treatment,Resistance,and Monitoring of Cancer[J].Clin Cancer Res,2017,23(3):623-629.

[6] Chen HX,Xu XX,Tan BZ,et al.MicroRNA-29b InhibitsAngiogenesisbyTargetingVEGFA through the MAPK/ERK and PI3K/Akt Signaling Pathways in Endometrial Carcinoma[J].Cell Physiol Biochem,2017,41(3):933-946.

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[8] Zhu J,Zheng Y,Zhang H.Targeting cancer cell metabolism:The combination of metformin and 2-Deoxyglucose regulatesapoptosis in ovarian cancer cells via p38 MAPK/JNK signaling pathway[J].Am J Transl Res,2016,8(11):4812-4821.

[9] Chun J,Kim YS.Platycodin D inhibits migration,invasion,and growth of MDA-MB-231 human breast cancer cells via suppression of EGFR-mediated Akt and MARK pathways[J].Chem Biol Interact,2013,205(3):212-221.

[10] Chun J,Joo EJ,Kang M,et al.Platycodin D induces anoikis and caspase-mediated apoptosis via p38 MAPK in ACS human gastri cancer cells[J].J Cell Biochem,2013,114(2):456-470.

Inhibitory Effect of Platycodin D on Proliferation of SGC7901 Cells and Moleclar Mechanism

DAI Qun,HUANG Xuan,CHEN Zhe First Affiliated Hospital of Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou(310053)

[Objective]To investigate the effects of platycodin D(PD)on the proliferation and apoptosis of human stomach cancer SGC7901 and the related mechanism.[Methods]SGC7901 was cultured in virto and was treated with 5～20μm·L-1concentrations of PD.Cell proliferation was examined by MTT assay.Cell apoptosis was detected by Annexin V FITC/PI double staining.The change of mitochondrial trans-membrane potential was measured by JC-1 staining.The potein expression of cleaved caspase-3,cleaved caspase-9,cleaved PARP,bcl-2,bax,p-ERK,ERK,p-JNK,JNK,p-p38 and p38 detected by Western blot.[Results]MTT results showed that PD inhibited the growth of SGC7901 cells in a dose-dependent manner at 24h and 48h.SGC7901 cells treated with PD for 24h showed significantly enhanced apoptosis and weakened mitochondrial membrane potential compared with the control cells.Western blot results showed that PD could up-regulate expression of cleaved PARP,cleaved caspase-3,cleaved caspase-9,bax,p-JNK,p-p38 protein,decreased bcl-2,p-ERK protein,the expression of ERK,JNK,p38 protein did not change significantly.[Conclusion]PD may inhibit the proliferation and induce the apoptosis of SGC7901 cells.These findings indicated that PD inhibited cell proliferation by inhibiting the ERK signaling.PD effect on bax and bcl-2 by activation of JNK and p38 signaling pathway resulted in the decrease of mitochondrial membrane potential and activation of caspase,which induced the apoptosis of cancer cells.

PD;SGC7901 cell apoptosis;mitochondrial membrane potential;bcl-2 family protein;MAPK signal pathway

R331

A

1005-5509（2017）07-0573-07

10.16466/j.issn1005-5509.2017.07.005

2017-03-16）

国家自然科学基金项目（81673745）

Fund project:National Natural Science Fund(81673745）

黄宣，E-mail：huangxuan1976@163.com