长期大强度运动对心室miR-155和miR-146a表达的影响

饶志坚，常 芸，潘珊珊，王世强

长期大强度运动对心室miR-155和miR-146a表达的影响

饶志坚1，2，常 芸2，潘珊珊1，王世强3

有规律的中低强度运动有益于身心健康，有助于降低慢性疾病的发病率［50］。越来越多的研究证据表明，长期大强度运动会对机体带来不利影响，尤其是心脏［1］。本课题组前期研究结果表明，长期大强度运动会导致右心室［2］和心房［6］纤维化，且长期大强度运动导致的心肌纤维化可能是通过TGF-β/SMAD通路实现的［4，5］。国内、外也有研究报道运动性心肌纤维化发生的分子和细胞机制［3，9，31］，但运动性心肌纤维化形成的病理机制仍不清楚。心肌纤维化与炎症反应之间的联系已经被广泛报道［11，22，38，45］，抑制炎症反应被证实是减轻心肌纤维化的有效手段［21，55］。Roozbeh等［49］人发现，长期大强度运动会引起心房炎症反应进而导致心房纤维化，表明运动性心肌纤维化的形成可能与炎症反应有关。

microRNAs（miRNAs）是一种非编码小RNA，长度约为21～25 nt［13］。它可结合到靶基因mRNA的3’-UTR，通过沉默或降解靶基因的mRNA来发挥其调控作用［39，59］。近年来，miRNAs被认为是炎症反应和细胞生理的重要调节因子［7，8，68］，其中，miR-155和miR-146a与炎症反应的关系被研究最多［27］。研究表明，miR-155和miR-146a的表达受TLR4/NF-κB通路的调节，两者可通过调节多种下游靶基因来调控炎症反应。miR-155可通过抑制SOCS1（suppression of cytokine signaling 1）和SHIP1（SH2 domain-containing inositol-5-phosphatase 1）的表达促进炎症反应，SOCS1和SHIP1是负向调控NF-κB通路的关键因子。相反，miR-146a被证实可负向调节TRAF6（TNF receptor-associated factor 6）、IRAK1（IL-1 receptor-associated kinases）和IRAK2，表明miR-146a可抑制炎症反应［35］。可见，miR-155和miR-146a有多种下游靶基因，对炎症反应的影响完全相反。目前，长期大强度运动对心肌miR-155和miR-146a表达的影响尚不明确。

本课题组的前期研究显示，长期大强度运动后心脏损伤主要在右心室，同时右心室出现纤维化，而左心室并未发生相似的变化［2］。因此，本研究探索长期大强度运动对左、右心室miR-155、miR-146a及它们相应下游靶基因SOCS1、IRAK1 mRNA表达的影响，探讨长期大强度运动是否是通过上调miR-155的表达并抑制miR-146a的表达，从而促进炎症反应并延长炎症反应过程，最终导致心肌纤维化。

1 研究对象与方法

1.1 实验对象

48只8周龄雄性SD大鼠，体重为220±8 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号为 SCXX（京）2012-0001。所有大鼠均以啮齿类动物普通饲料喂养，饲养于国家体育总局体育科学研究所 ABSL-3 级动物房，室温为20～25°C，相对湿度为55%～70%，饲养室昼夜循环为12/12（7：00～19：00）。

1.2 分组与运动方案

所有大鼠适应性喂养3天后，进行1周的适应性跑台训练，15 min/天，速度为15 m/min。随后将大鼠随机分为8周组、12周组和16周组，每组又分为安静组（Sed）和大强度运动（IE）组，共6组，每组8只大鼠。运动强度参照Bedford方案，大强度组（最大摄氧量 81.00% ± 3.5% VO2max）为：速度28 m/min，坡度10°。大强度运动时先以15 m/min的速度跑5 min，然后在随后的5 min内逐渐增到28 m/min。安静组自由活动，大强度组每天运动1 h，每周运动5天。

1.3 取材

各组在全部运动结束后，24 h后处死取材。麻醉后快速分离心脏取左心室（Left Ventricular，LV）、右心室（Right Ventricular，RV）， −80℃保存用于RT-PCR。

1.4 RT-PCR检测microRNA和mRNA的表达水平

采用Trizol法提取右心室总RNA，采用TAKARA公司的Mir-X miRNA First-Strand Synthesis试剂盒，按操作说明书添加试剂，然后37℃反应60 min，之后85℃反应5 min以使酶失活。最后添加90 μl的去离子水，得到100 μl的microRNA第一链，用于miR-155和miR-146a的荧光定量。采用TAKARA公司的PrimeScript™ RT Master Mix试剂盒，按操作说明书添加试剂，然后37℃反应15 min，之后85℃反应5 s以使酶失活。得到cDNA，用于SOCS1 mRNA和IRAK1 mRNA的荧光定量。miR-155和miR-146a的荧光定量采用TAKARA公司的SYBR Premix Ex Taq，以U6为内参，miR-155、miR-146a和U6分别按操作说明书添加试剂。SOCS1 mRNA和IRAK1 mRNA的荧光定量以GAPDH为内参，同样采用TAKARA公司的SYBR Premix Ex Taq。引物信息见表1，反应条件为预变性90℃ 30 s，PCR反应40个循环95℃5秒、60℃31 s。得到的数据采用2–ΔΔCt的方法计算microRNA和mRNA的相对表达量。

表1 RT-PCR实验基因引物序列表Table 1 Gene Primer Sequences for RT-PCR

1.5 数据统计与分析

所有数据用SPSS 22.0进行分析处理，数据用平均值±标准差表示，同一时间点组间比较采用独立样本t检验，P＜0.05为有显著性差异，P＜0.01为有非常显著性差异。采用GraphPad Prism 6.0作图。

2 实验结果

2.1 左、右心室miR-155表达水平的变化

实验结果显示，与相应的安静组相比，8周、12周和16周大强度运动后，左心室miR-155的表达水平均无显著性差异（图1）；而右心室miR-155的表达水平均显著性升高（图2）。

图1 各组大鼠左心室Mir-155相对于U6的表达水平柱状图Figure 1. Expression of Mir-155 to U6 in Left Ventricular

图2 各组大鼠右心室Mir-155相对于U6的表达水平柱状图Figure 2. Expression of Mir-155 to U6 in Right Ventricular

2.2 左、右心室SOCS1 mRNA表达水平的变化

实验结果显示，与相应的安静组相比，8周、12周和16周大强度运动后，左心室SOCS1 mRNA的表达水平均无显著性差异（图3）；右心室SOCS1 mRNA的表达水平有下降的趋势，但不具有显著性差异（图4）。

2.3 左、右心室miR-146a表达水平的变化

实验结果显示，与相应的安静组相比，8周、12周和16周大强度运动后，左心室miR-146a的表达水平均无显著性差异（图5）；而右心室miR-146a的表达水平在8周和12周大强度运动后无显著性差异，但16周大强度运动后，miR-146a的表达水平显著升高（图6）。

图3 各组大鼠左心室SOCS1相对于GAPDH的mRNA表达水平柱状图Figure 3. mRNA Expression of SOCS1 to GAPDH in Left Ventricular

图4 各组大鼠右心室SOCS1相对于GAPDH的mRNA表达水平柱状图Figure 4. mRNA Expression of SOCS1 to GAPDH in Right Ventricular

图5 各组大鼠左心室Mir-146a相对于U6的表达水平柱状图Figure 5. Expression of Mir-146a to U6 in Left Ventricular

图6 各组大鼠右心室Mir-146a相对于U6的表达水平柱状图Figure 6. Expression of Mir-146a to U6 in Right Ventricular

2.4 左、右心室IRAK1 mRNA表达水平的变化

实验结果显示，与相应的安静组相比，8周、12周和16周大强度运动后，左心室IRAK1 mRNA的表达水平均无显著性差异（图7）；右心室IRAK1 mRNA的表达水平均显著性上调（图8）。

图7 各组大鼠左心室IRAK1相对于GAPDH的mRNA表达水平柱状图Figure 7. mRNA Expression of IRAK1 to GAPDH in Left Ventricular

图8 各组大鼠右心室IRAK1相对于GAPDH的mRNA表达水平柱状图Figure 8. mRNA Expression of IRAK1 to GAPDH in Right Ventricular

3 讨论

长期大强度运动可导致心肌发生炎症反应，而miR-155和miR-146a是调节炎症反应的重要因子。本研究观察8周、12周和16周的大强度运动对左、右心室miR-155和miR-146a及其相应的下游靶基因SOCS1和IRAK1 mRNA表达水平的影响，探讨运动性心肌纤维化和炎症与miR-155、miR-146a之间的联系。

miR-155是与炎症相关的micro RNAs中最重要的一种。目前研究已确认，miR-155有26种靶基因，包括多种转录调节蛋白、激酶和DNA结合蛋白［19］，其中，涉及炎症相关过程的因子大部分是抗炎因子，如SOCS1和SHIP1，miR-155通过抑制这些靶基因的表达发挥其生物学功能，因此，miR-155被认为是一种促炎因子［23，41］。研究发现，miR-155在激活的B细胞和T细胞及单核巨噬细胞中高度表达，这些细胞被TLR、炎症因子和特异性抗原激活时，miR-155是第一个被上调的［40，52，53］，在免疫反应过程中，miR-155通过不同的下游靶基因发挥不同的作用。如，通过抑制AID和PU.1的激活来促进B细胞中Ig族蛋白转化为Ig G［16，47，53］；通过直接抑制SOCS1的表达来影响T细胞的功能［34］；通过直接抑制SHIP1的表达导致骨髓细胞增殖紊乱［41，42］，这表明，miR-155可能在炎症和免疫相关疾病的病理生理过程中发挥重要作用。近年来实验证据也表明，在由心肌梗死［69］、缺血再灌注［17］、动脉粥样硬化［65］、皮肤损伤［63］等引起的炎症及心肌炎［25］和血管内皮炎症［58］的情况下，miR-155表达水平显著升高，而通过基因或药物的方法抑制miR-155的表达可有效减轻炎症反应。

SOCS1是miR-155参与炎症反应过程中的直接靶基因之一，miR-155可直接结合到SOCS1 mRNA的3’-UTR，从而抑制SOCS1的表达，SOCS1是调节炎症信号的关键因子，它负向调节炎症反馈［30，66］，缺乏SOCS1可导致细胞和动物发生过度炎症反应［12，24］。多项体内、外实验证实，miR-155是通过抑制SOCS1的表达来调节炎症反应的［37，65］。

目前，鲜有研究报道长期大强度运动对miR-155及其下游靶基因SOCS1表达的影响。本实验结果显示，8周、12周、16周大强度运动都可显著上调SD大鼠右心室miR-155的表达水平，且随着运动时限的增加，miR-155的表达水平随之提高。有趣的是，大鼠左心室miR-155的表达水平在长期大强度运动后并未发生显著性变化。结合前期研究结果，长期大强度运动可造成右心室和右心房cTnI水平升高且出现纤维化，而对左心室没有影响［2］。表明，长期大强度运动可能导致右心室损伤，通过上调miR-155的水平促进炎症反应，最终导致右心室心肌纤维化。相似的，有研究表明，miR-155在许多炎性纤维化中表达水平显著升高，包括非典型肺纤维化［33］、酒精性［36］和非酒精性［44］肝纤维化、肾纤维化［60］和皮肤纤维化［63］，及在这些疾病的动物模型［10，36］中也被证实。而抑制miR-155可显著改善高血压［10］、糖尿病［46］诱导的心肌纤维化。值得注意的是，本试验虽然发现，大强度运动后右心室miR-155表达水平显著性升高，但它似乎并不是通过下调SOCS1 mRNA表达水平来促进炎症反应的，因为大强度运动后右心室SOCS1 mRNA表达水平有下降的趋势，但没有显著性差异。因此，本模型中miR-155是否是通过靶向作用于SOCS1以促进炎症反应尚需进一步的研究来确认。

研究发现，miR-155除了通过促进炎症导致组织纤维化外，还可通过直接作用于CK1α影响Wnt/β通路［62］，及直接作用于RhoA或RPTOR影响TGF-β通路［54］，这两条通路都是促纤维化通路，最终导致组织纤维化。

miR-146a是另一种与炎症密切相关的microRNA，但与miR-155相反，miR-146a通过抑制TRAF6、IRAK1和IRAK2的表达来抑制炎症反应。TRAF6和IRAK1参与TLR和IL-1R信号通路的调节［14］。TLR刺激后，细胞胞浆中的配体蛋白MyD88和TRIF被募集并与受体结合，导致TLR信号的激活［52］。在MyD88通路中，MyD88募集IRAK1，进而磷酸化并激活TRAF6，这条反应链导致IκB的磷酸化和降解，使NF-κB进入细胞核激活炎症基因的转录［32，52］。可见，IRAK1降解是防止炎症反应过度的一个重要负反馈机制。

目前研究发现，miR-146a在不同炎症性疾病中的表现有所不同。糖尿病往往伴随多器官、多组织的炎症反应和纤维化，因此，miR-146a在糖尿病模型中的影响研究最多。研究发现，一方面，在糖尿病小鼠创面［61］，糖尿病大鼠主动脉［18］、肾脏［20］和背根神经节［56］，1型和2型糖尿病患者血清中［64］miR-146a表达水平下降，同时，IRAK1、TRAF6和NF-κB表达上调，IL-6、IL-1β、MCP-1、Col1α和Col4α1表达水平升高；另一方面，糖尿病大鼠肾脏［26］、坐骨神经［67］及糖尿病患者肾脏［26］、角膜缘上皮细胞中［57］miR-146a表达水平升高，同时，IRAK1、TRAF6和NF-κB表达降低。尽管miR-146a在不同研究中的表现有所不同，但多数体内、外实验都证实，采用miR-146a基因敲除或miR-146a拮抗剂可显著增加IRAK1和TRAF6的表达水平，NF-κB的活性和蛋白表达水平都显著增加［28］。相反，采用miR-146a转染或miR-146a相似物干预，miR-146a表达水平显著升高，进而通过降低IL-8、MCP-1 mRNA和蛋白的表达，从而防止炎症反应的发生［48］。可见，miR-146a在抗炎过程有正向调控作用，在炎症反应负反馈回路中有重要作用，可防止压倒性炎症反应的发生。

长期大强度运动对miR-146a及其下游靶基因IRAK1 mRNA表达的影响同样鲜见报道。本实验发现，长期大强度运动后，左心室miR-146a及IRAK1 mRNA的表达水平并未发生显著性变化。8周和12周大强度运动有上调右心室miR-146a表达水平的趋势，但并没有显著性差异，而16周大强度运动显著增加了右心室miR-146a的表达水平。有趣的是， 8周、12周和16周大强度运动后右心室IRAK1 mRNA并未降低，反而显著性升高。Sun等［51］人发现，IL-1β可使miR-146a表达水平升高17.5倍，而抑制NF-κB、JNK1/2、PI3K后，miR-146a表达水平分别下降1.9倍、5.3倍和9.7倍。miR-146a相似物可降低IL-1β、IL-6的表达水平，但miR-146a抑制剂并不能下调IL-1β、IL-6的表达水平，表明炎症反应过程中miR-146a上调可能是为了防止过度炎症的发生。Kong等［29］人也发现，MRP8/TLR4诱导的星形胶质细胞炎症反应中，miR-155和miR-146a表达水平同时增高，且IL-1β、TNF-α及IL-6的表达水平也升高，表明此时miR-146a表达水平上调可能是防止压倒性炎症反应的发生，但它们并未检测IRAK1 mRNA的表达水平。而Dalbeth等［15］人也证实，miR-146a在炎症反应过程中发挥转录制动作用。然而，本研究中，miR-146a可能并不是通过抑制IRAK1 mRNA的表达来制动炎症反应的，因为，尽管16周大强度运动后右心室miR-146a表达水平显著性上调，但IRAK1 mRNA的表达水平并没有随之下调，反而显著性升高。此外，8周、12周和16周大强度运动后右心室IRAK1 mRNA表达水平升高，表明长期大强度运动后右心室处于炎症状态。因此，本试验中大强度运动后右心室还是以炎症反应为主，miR-146a上调可能是为了制动炎症因子的转录，防止发生过度的炎症反应，但miR-146a是通过哪个靶基因发挥其生物学作用的还需进一步的研究。

此外，Palomer等［43］人发现，miR-146a可通过直接作用于Fos抑制MMP-9的活性，减少心肌细胞细胞外基质重塑，表明miR-146a除了通过调节炎症反应影响组织纤维化外，还能直接影响纤维化过程。

综上所述，长期大强度运动对左心室miR-155、miR-146a及SOCS1、IRAK1 mRNA的表达水平没有影响。而长期大强度运动后，右心室miR-155、IRAK1 mRNA表达水平升高可能是造成右心室炎症和纤维化的原因之一。此外，16周大强度运动后miR-146a表达水平升高可能是为了制动炎症因子的转录，防止发生过度的炎症反应。但长期大强度运动后右心室miR-155是通过调节哪些靶基因来促进炎症反应，及miR-146a是通过调节哪些靶基因防止过度炎症的发生？长期大强度运动后右心室miR-155和miR-146a除了调节炎症通路导致右心室心肌纤维化外，是否还可直接通过调节促纤维化通路中的因子来影响右心室心肌纤维化？这些问题都需要进一步的探究。

4 结论

长期大强度运动通过上调右心室miR-155的表达水平促进炎症反应是导致运动性右心室心肌纤维化的可能机制。

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Effects of Long-term Intensive Exercise on the Expression of miR-155 and miR-146a in Ventricles

RAO Zhi-jian1，2，CHANG Yun2，PAN Shan-shan1，WANG Shi-qiang3

目的：研究长期大强度运动对心室miR-155和miR-146a表达的影响，探讨miR-155和miR-146a在调节运动性心肌纤维化和炎症中的作用。方法：48只8周龄雄性SD大鼠，随机分为对照组（Sed）和大强度运动组（IE），每组又分为8周、12周和16周，共6组，每组8只。对照组自由活动，大强度组以速度28 m/min，坡度10°的条件每天运动1 h，每周运动5天。最后一次运动后24 h后麻醉处死，迅速分离心脏，取左、右心室。采用RT-PCR法检测大鼠左、右心室miR-155和miR-146a及它们相应下游靶基因SOCS1和IRAK1 mRNA的表达水平。结果：长期大强度运动后，大鼠右心室miR-155表达水平显著升高，而左心室miR-155表达水平变化不大；16周大强度运动后，大鼠右心室miR-146a表达水平显著升高，而长期大强度运动对左心室miR-146a表达水平影响不大。长期大强度运动后，左、右心室SOCS1 mRNA的表达水平都没有发生变化；长期大强度运动后，右心室IRAK1 mRNA表达水平显著升高，而左心室IRAK1 mRNA的表达水平变化不大。结论：长期大强度运动通过上调右心室miR-155的表达水平促进炎症反应是导致运动性右心室心肌纤维化的可能机制。

大强度运动；心肌纤维化；炎症；miR-155；miR-146a

Objective：To study the effects of long-term intensive exercise on the expression of miR-155 and miR-146a in ventricular，and to discuss the role of miR-155 and miR-146a in exercise induced myocardial fibrosis and inflammation. Methods：48 male SD rats were divided into sedentary （Sed）group and intensive exercise （IE） group randomly，and every group has three time points （eight-week，twelve-week and sixteen-week），thus there are 6 groups （n=8）. Rats in sedentary groups are free activities. Rats in IE group run on treadmill at the speed of 28 m/min，10° slope for 8 weeks，twelve weeks or 16 weeks （1 hour per day，5days per week）. After the last training，all rats were sacrificed，separate left and right ventricular. Expression level of miR-155，miR-146a and their downstream target gene SOCS1，IRAK1 mRNA was measured by RT-PCR. Results：Long-term intensive exercise increasing miR-155 expression level in right ventricular，but without changes in left ventricular. Expression level of miR-146a in right ventricular was increased after sixteen-week intensive exercise，but no alteration in left ventricular. After long-term intensive exercise，SOCS1 mRNA expression level without changes both in left and right ventricular. The expression level of IRAK1 mRNA in right ventricular was increased after long-term intensive exercise，but without changes in left ventricular. Conclusion：Long-term intensive exercise promotes inflammation via up-regulate miR-155，which is the potential mechanism of exercise-induced myocardial fibrosis.

intensive exercise；myocardial fibrosis；inflammation；miR-155；miR-146a

G804.7

A

1000-677X（2017）07-0037-07

10. 16469/j. css. 201707005

2017-04-23；

2017-06-22

国家体育总局体育科学研究所基本科研业务费资助项目（16-21）。

饶志坚，男，在读博士研究生，主要研究方向为运动心脏病生理和病理，Tel：010-87182567，E-mail：1101294556@qq.com；常芸，女，研究员，博士，博士研究生导师，主要研究方向为运动员心脏病生理和医务监督，Tel：010-87182526，E-mail：changyun@ciss.cn；潘珊珊，女，教授，博士，博士研究生导师，主要研究方向为运动与心血管形态和机能，Tel：021-51253252，E-mail：panshan-shan@sus.edu.cn。

1. 上海体育学院 运动科学学院，上海 200438； 2. 国家体育总局体育科学研究所，北京 100061；3. 湖南工业大学 体育学院，湖南 株洲 412000 1. Shanghai University of Sport，Shanghai 200438，China；2. China Institute of Sport Science，Beijing 100061，China；3. Hunan University of Technology，Zhuzhou 412000，China.