间歇有氧运动激活miR-21/SIRT1/NF-κB通路改善心梗大鼠肾功能研究

林琴琴，耿元文，田振军

间歇有氧运动激活miR-21/SIRT1/NF-κB通路改善心梗大鼠肾功能研究

林琴琴1，耿元文1，田振军2

临床上，心肌梗死 （Myocardial Infarction，MI） 患者常伴有由肾小球滤过功能受损和水重吸收异常引起肾功能不全而导致的下肢浮肿［9，13］。水通道蛋白家族（aquaproins，AQPs），尤其是通过精氨酸加压素 （arginine vassopressin，AVP） 2型受体（Vasopressin V2-receptor，V2R）调控的AQP2在肾脏水的重吸收中发挥主要作用［11］。我们的前期研究表明，持续和间歇有氧运动均可减少慢性心衰大鼠肾脏AQP2的表达［1，23］，但间歇有氧运动对急性心梗后肾脏AQP2蛋白表达及其机制尚不清楚。

有文献报道，心梗大鼠心肌缺血部位外源性注射microRNA-21 （miR-21）可减少心肌纤维化，降低心梗面积，抑制细胞凋亡，保护心脏组织结构和功能［15］。除心脏保护作用外，miR-21过表达可抑制肾脏炎症反应和细胞凋亡，保护缺血再灌注导致的肾脏损伤［31］。运动干预可上调创伤性脑损伤大鼠大脑miR-21表达，进而减轻脑水肿，降低病变体积［3］。但针对间歇有氧运动，是否可通过上调心梗大鼠肾脏miR-21表达，改善肾脏功能，鲜有文献报道。

组蛋白去乙酰化酶Sirtuin1 （SIRT1） 在肾脏疾病发生发展中的作用及其调控机制日益受到关注。肾脏特异过表达SIRT1可显著增加线粒体数目和功能，降低活性氧产生，抑制肾脏细胞凋亡，减缓顺铂导致的急性肾损伤［16］。而通过核因子κB （nuclear factor-kappa B，NF-κB） 信号通路，SIRT1抑制肾脏炎症反应［12］，减少脑、肺水容量［25，27］。新近研究表明，miRs是SIRT1的重要调节者［6］，但miR-21与SIRT1信号通路间的关系及间歇有氧运动是否通过miR-21激活SIRT1-NF-κB通路参与肾脏功能的调节，少见文献报道。因此，本研究拟探讨间歇有氧运动对MI大鼠肾脏miR-21及其下游通路SIRT1-NF-κB表达和肾脏功能的影响。

1 材料与方法

1.1 主要仪器和试剂

主要试剂：DAB显色试剂盒（购于武汉博士德）、生化试剂（购于南京建成生物科技有限公司）、TRIzol（购于Inventragtion）、反转录试剂盒（购于TAKARA）、兔抗多克隆抗体SIRT1（购于Bioworld）、乙酰化NF-κBp65 （Lys310，购于美国Abcam）、AQP2（购于美国Santa）、PCR引物（购于上海生工）、ELISA试剂盒（购于美国R&D公司）等。

主要仪器： PowerLab 8/30生理信号采集系统、BM-Ⅱ型病理组织包埋机、YT-6C生物组织摊烤片机、LEICA RM2126切片机、Bio-Rad电泳仪和转移槽、Bio-Rad凝胶成像系统、BX51奥林巴斯光学显微镜、Thermo低温高速离心机、尼康荧光显微镜、Bio-Rad PCR扩增仪等。

1.2 动物分组与MI模型制备

动物分组： 3月龄雄性SD大鼠36只，初始体重180～220 g，由西安交通大学医学院实验动物中心提供。随机分为假手术组 （Sham组）、心肌梗死组 （MI组）、心梗＋间歇运动组（ME组），每组12只。动物室内温度为20℃～23℃，湿度为50%～60%，标准啮齿类动物干燥饲料喂养，自由饮食，光照与非光照各12 h。Sham组大鼠常规笼内安静饲养，MI 组结扎左冠状动脉前降支（LAD）建立MI 模型。ME 组进行为期8周的动物跑台训练。

MI模型制备： 5%戊巴比妥钠腹腔麻醉，采用自制大鼠呼吸面罩进行辅助呼吸（60次/min，潮气量10 mL，呼吸比1：2），PowerLab 8/30生理信号采集系统记录大鼠肢导心电图 （ECG）。开胸暴露心脏，体视显微镜下，在左心耳根部和肺动脉圆锥左缘交界下1～2 mm 处结扎左冠状动脉前降支（ LAD）。结扎后可见左室靠近心尖部位的颜色逐渐变浅或变白，心电图出现S-T段抬高或T波倒置现象。以此判定MI造模成功，之后逐层缝合关胸。为了排除手术因素干扰，Sham组大鼠手术过程同上，但仅穿线而不结扎LAD。ME组大鼠在MI模型成功后1 周开始训练。

1.3 间歇有氧运动方案

运动方案参考Wisloff训练模型略加改动［31］。ME组大鼠术后1周进行跑台运动。第1周为适应性训练 （10～15 m/min，30 min/天，共5 天）。正式训练采用递增式跑台训练，起始速度10 m/min，时间为10 min。之后进行间歇有氧运动，速度为25 m/min，运动时间7 min；后间歇3 min，速度为15 m/min，依次交替进行。每天运动总时间为60 min，每周训练5 天，连续训练8周。

1.4 样本处理及生化指标测定

8 周运动结束后次日，测定心电图，膀胱取尿、腹主动脉取血后，迅速摘取肾脏，置于10%中性甲醛溶液中固定24 h，常规石蜡包埋、制片（5 μm），用于免疫荧光染色实验。另取肾脏，液氮骤冷，转移至－80℃超低温冰箱保存备用。

血液及尿液样本离心后留取上清液，严格参照试剂说明书对血清尿酸（uric acid，UA）及尿液尿酸和尿蛋白（urine protein，UP）含量进行测定；运用ELISA法，严格按照试剂盒说明书操作步骤对血清AVP及尿液AQP2的含量进行检测。

1.5 免疫荧光化学染色

切片脱蜡至水，PBS清洗，微波抗原修复，PBS清洗，正常山羊血清封闭液 （37℃，60 min），一抗孵育 （AQP2，1：100），4℃过夜，PBS清洗，孵育二抗 （37℃，30 min），PBS清洗，甘油封闭液封片。每组均设置空白对照（PBS代替一抗和二抗）和阴性对照（PBS代替一抗）。尼康荧光显微镜观察拍片。

1.6 Western Blot

采用RIPA提取肾脏总蛋白质，Bradford法测定蛋白浓度。10%～12% SDS聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳分离后，转至PVDF膜，丽春红染膜，3% BSA室温封闭30 min后，分别加入兔抗多克隆抗体SIRT1 （1：400）、乙酰化NF-κBp65 （1：400）和NF-κBp65 （1：400），4℃过夜，室温复温30 min后，加入HRP标记的羊抗兔IgG二抗抗体 （1：10 000） 孵育30 min，TBST清洗，ECL发光。内参为GAPDH （1：10 000）。

1.7 RT-qPCR

用TRIzol试剂提取肾脏总RNA，严格按照反转录试剂盒说明书操作步骤反转录合成cDNA，后进行RT-qPCR反应，内参为GAPDH。引物序列如下，V2R上游引物：5’-ATCTGCCGCCCTATGCTA-3’，下游引物：5’-CTGCCATTTCCCACATCAC-3’，扩增产物长度为140 bp。GAPDH 上游引物：5’-ACAGCAACAGGGTGGTGGAC-3’，下游引物：5’-TTTGAGGGTGCAGCGAACTT-3’，扩增产物为252 bp。反应条件如下：95℃ 10 min，1 循环；95℃ 15 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，40 循环；72℃ 10 min。每个样品重复检测3次。利用2-△△Ct法计算相对基因表达量。

用TRIzol试剂提取肾脏总RNA，按microRNA反转录试剂盒说明书方法反转录合成cDNA，再以此cDNA为模板按PCR试剂盒进行PCR反应。引物和探针由宝生物工程有限公司（TaKaRa）设计和合成，U6为内参。反应条件如下：95℃ 30 s，1 个循环；95℃ 5 s，60℃ 20 s，39 个循环。每个样品重复检测3次。利用2-△△Ct法计算miR-21的相对表达量。

1.8 数据统计

所有数据均采用SPSS 17.0统计软件进行处理，采用单因素方差分析 （One-way Analysis of Variance，ANOVA）进行统计学分析。显著性差异选择P＜0.05和P＜0.01水平。所有数据以均数±标准差 （X±SD）表示。

2 研究结果

2.1 心电图记录结果

ME 组8 周有氧运动后，观察各组大鼠心电图 （图1）：Sham组大鼠心电图正常，P、Q、R、S、T 各波段规则；大鼠MI 后心电图出现S-T 段抬高或T 波倒置现象，由此断定MI模型造模成功； ME 组大鼠心电图趋于正常，表明间歇有氧运动对MI模型大鼠是安全有效的，具有保护作用。

图1 本研究8周实验结束后各组大鼠心电图Figure 1. ECG Maps in Rats After 8 Weeks

2.2 肾脏miR-21、 SIRT1和NF-κBp65表达结果

与Sham组比较，MI组大鼠肾脏miR-21表达增加，SIRT1表达减少，NF-κBp65乙酰化水平显著升高 （均为P＜0.01）。与MI组比较，ME组肾脏miR-21表达增加，SIRT1表达增加，NF-κBp65乙酰化水平明显减少 （分别为P＜0.01、P＜0.01和P＜0.05）。相关性分析结果显示，肾脏miR-21与SIRT1呈显著正相关 （R=0.608，P＜0. 01，图2）。

图2 各组大鼠肾脏miR-21、SIRT1和NF-κBp65表达变化示意图Figure 2. The Changed Expression of miR-21，SIRT1 and NF-κBp65 in Rat Kidney

2.3 肾脏AVP和V2R表达结果

ELISA和RT-qPCR结果如图3所示：与Sham组比较，MI组大鼠血清AVP水平升高，肾脏V2R mRNA表达显著增加 （P＜0.01）。与MI组比较，ME组血清AVP水平降低，肾脏V2R mRNA表达减少 （P＜0.01） 。

图3 各组大鼠AVP和V2R表达变化柱状图Figure 3. The Changed Expression of AVP and V2R in Rat Kidney

2.4 肾脏AQP2表达结果

图4 各组大鼠AQP2表达变化Figure 4. The Changed Expression of AQP2 in Rat Kidney and Urine

免疫荧光染色结果如图4所示，Sham组大鼠AQP2主要表达于肾脏集合管主细胞膜上。与Sham组比较，MI组大鼠AQP2在肾脏集合管主细胞膜和基底膜上均有表达，且荧光强度较强。与MI组比较，ME组大鼠AQP2在肾脏集合管主细胞膜和基底膜上表达减少，且荧光强度明显减弱。利用Western Blot、RT-qPCR和ELISA方法进一步探讨了间歇运动对MI大鼠肾脏AQP2表达的影响。结果显示，MI组大鼠肾脏AQP2蛋白和mRNA表达及尿液AQP2水平显著高于Sham组 （均为P＜0.01）。与MI组比较，间歇运动可显著减少ME组大鼠肾脏AQP2蛋白和mRNA的表达，降低尿液AQP2含量 （均为P＜0.01）。

2.5 肾功能测定结果

与Sham组比较，MI组大鼠血清尿酸和尿液尿蛋白水平显著增加 （均为P＜0.01），尿液尿酸水平明显减少 （P＜ 0.01）。与MI组比较，ME组大鼠血清尿酸和尿液尿蛋白水平显著减少 （分别为P＜0.05和P＜0.01），而尿液尿酸水平明显增加 （P＜0.01，图5）

图5 各组大鼠尿酸和尿蛋白表达变化柱状图Figure 5. The Changed Expression of Uric Acid and Urine Protein

3 分析与讨论

3.1 间歇运动可改善心梗后肾功能，减缓水潴留

心梗后肾脏胶原合成与降解失衡，心肌细胞外基质沉积异常，氧化应激增加［18］，肾血流减少［27，28］，肾脏纤维化与液体潴留，导致肾脏病理性重构和肾脏功能紊乱［23］。本实验室前期研究证实，持续和间歇运动可有效改善心衰大鼠肾脏纤维化和肾脏功能紊乱［1，23］。本研究结果显示，MI大鼠血清尿酸水平和尿液尿蛋白较Sham组大鼠显著升高，尿液尿酸浓度明显降低。8周间歇有氧运动后，ME组大鼠血清尿酸水平显著减少，尿液尿酸水平明显增加，同时伴随尿液尿蛋白水平的明显降低。表明，间歇运动干预改善了心梗大鼠肾脏功能。同时，本研究还发现，心梗大鼠8周间歇运动干预后血清AVP浓度和肾脏V2R mRNA水平降低，肾脏内髓质AQP2表达减少，肾脏集合管主细胞膜上AQP2表达降低，肾脏AQP2蛋白和mRNA表达减少，尿液AQP2浓度亦显著降低。说明，间歇运动可抑制AVP及V2R mRNA的表达，从而抑制AQP2表达，减少水通路开放数量，降低水的重吸收，增加尿排出量，缓解水潴留。但间歇运动对心梗后肾脏保护效应的机制研究，缺少文献报道。本研究重点关注间歇运动对改善心梗大鼠肾脏水潴留及miR-21-SIRT1-NF-κB通路激活是否会产生影响。

3.2 间歇运动可激活心梗大鼠肾脏miR-21/SIRT1/NF-κB通路，保护肾功能

有研究表明， miR-21高表达于心血管系统，且在心肌成纤维细胞和心梗后心室重塑中发挥重要作用［4，5］。心梗大鼠心肌缺血部位外源性注射miR-21可减少心肌纤维化，降低心梗面积，抑制细胞凋亡，保护心脏组织结构和功能［15］。除保护心脏作用外，miR-21在肾脏功能调节中发挥重要作用。病理情况下，miR-21预处理抑制肾脏纤维化，提高肾小球滤过功能，减缓病理性肾脏损伤［19，22］。上调miR-21表达可抑制肾脏炎症反应，抑制肾小管上皮细胞凋亡，保护缺血再灌注导致的肾脏损伤［32］。推测miR-21可能与改善心梗后肾功能不全关系密切。因此认为，miR-21高表达有助于保护肾脏功能，内源性miR-21分泌增多的技术与方法值得高度关注。运动是刺激机体内源性物质表达分泌极其重要的方法之一。研究发现，有氧运动可显著增加慢性心力衰竭患者主动脉内皮细胞miR-21的表达［30］。运动能否有效刺激心梗后肾脏大量产生miR-21保护肾脏功能研究值得探讨。本研究结果显示，间歇有氧运动显著促进心梗后肾脏miR-21的表达。

新近研究发现，SIRT1高表达于肾髓质小管细胞中，保护和维持肾脏功能［10］。SIRT1的肾脏保护作用与其负性调节核因子NF-κB密切相关，NF-κB是参与肾脏疾病发展的主要转录因子［20，24］。SIRT1可直接与NF-κB转录活性至关重要的位点RelA/p65亚基相互作用，去乙酰化RelA/p65亚基的Lys310残基，抑制其活性，进而抑制下游通路靶基因的表达，保护受损肾脏［8，21］。体外实验证实，SIRT1激活可明显抑制小鼠皮质集合管细胞NF-κB活性，减缓肾脏损伤［2］。动物实验进一步证实，SIRT1活化可显著下调代谢综合征大鼠肾脏乙酰化 NF-κB表达， 降低血清尿酸水平，缓解肾脏损伤［25］。研究表明，NF-κB参与肾脏AQP2的表达调控［17］。本研究发现，心梗大鼠肾脏SIRT1表达减少，NF-κB乙酰化水平增加，血清尿酸水平升高，AQP2表达增加；间歇有氧运动组心梗大鼠肾脏SIRT1表达增加， NF-κB乙酰化表达减少，血清尿酸水平和AQP2表达降低。提示，间歇有氧运动可能通过上调肾脏SIRT1表达，靶向NF-κB信号通路，提升心梗大鼠肾脏功能。另有研究证实，miRs通过调节靶基因表达在肾脏疾病进展中发挥重要作用［7，14］，且SIRT1表达受miRs调节［6］。有研究表明，抑制miR-449可增强肾小管上皮细胞SIRT1表达，减缓顺铂导致的急性肾损伤［29］；而减少miR-23b-3p表达可提高视网膜内皮细胞SIRT1表达，抑制乙酰化NF-κB表达，减轻高糖诱导的糖尿病性视网膜病变［33］。

本研究发现，间歇有氧运动显著增加心梗大鼠肾脏miR-21和SIRT1的表达，同时，肾脏miR-21表达水平和SIRT1表达呈显著正相关。推测，间歇有氧运动可能通过增加心梗大鼠肾脏局部miR-21表达，激活其下游信号通路SIRT1-NF-κB。表明，间歇运动改善心梗大鼠肾脏功能，发挥肾脏保护效应，可能与miR-21-SIRT1-NF-κB通路的激活有关。

4 结论

间歇有氧运动可显著提高心梗大鼠肾脏miR-21表达，激活miR-21/SIRT1/NF-κB通路，改善心梗大鼠肾脏功能。间歇有氧运动改善心梗大鼠肾脏功能与提高心梗大鼠肾脏miR-21表达，激活miR-21/SIRT1/NF-κB通路关系密切。运动干预microRNAs表达研究与心肾保护效应，将为心梗及肾脏疾病患者运动康复手段筛选提供新思路。

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Aerobic Interval Training Activates the Renal miR-21/SIRT1/NF-κB Signalling Pathway and Improves Renal Function in a Rat Model with Myocardial Infarction

LIN Qin-qin1，GENG Yuan-wen1，TIAN Zhen-jun2

目的：探讨间歇有氧运动激活心肌梗死（Myocardial Infarction，MI）大鼠肾脏miR-21/ SIRT1/NF-κB通路改善肾功能的作用。方法：3月龄雄性SD大鼠，随机分为假手术组（ Sham）、心肌梗死组（ MI）、心梗＋间歇运动组（ME），每组12只。左冠状动脉前降支（Left Anterior Descending Coronary Artery，LAD）结扎建立MI模型，ME组在心梗1周后采用小动物跑台进行8周间歇训练。训练结束后测定各组大鼠心电图变化，采用紫外分光光度法测定尿酸和尿蛋白水平，免疫荧光染色法测定AQP2表达，ELISA法测定血清AVP和尿液AQP2，RT-qPCR 检测肾脏AQP2、V2R和miR-21表达，Western Blot 检测肾脏AQP2、SIRT1和乙酰化NF-κBp65 蛋白表达。结果：心梗大鼠肾脏功能显著降低，肾脏AVP、V2R和AQP2表达增多，尿液AQP2表达增多，水潴留严重。间歇运动可有效改善心梗大鼠肾脏功能，降低肾脏AVP、V2R和AQP2表达，减少尿液AQP2水平，上调肾脏miR-21和SIRT1的表达，抑制NF-κB乙酰化水平；且发现肾脏miR-21表达水平与SIRT1表达呈显著正相关。结论：间歇有氧运动可显著提高心梗大鼠肾脏miR-21表达，激活miR-21/SIRT1/NF-κB通路，改善心梗大鼠肾脏功能。间歇有氧运动改善心梗大鼠肾脏功能与提高心梗大鼠肾脏miR-21表达，激活miR-21/SIRT1/NF-κB通路关系密切。运动干预microRNAs表达研究与心肾保护效应，将为心梗及肾脏疾病患者运动康复手段筛选提供新思路。

心肌梗死；间歇有氧运动；肾功能；miR-21；SIRT1/NF-κB；大鼠

Objective：To determine the effects of aerobic interval training （AIT） on the expressions of renal miR-21，SIRT1，Ac-NF-κB and AQP2 in rats with myocardial infarction （MI）. Methods：male Sprague Dawley rats were randomly divided into Sham-operated group （Sham），Sedentary MI group （MI） and MI with AIT group （ME） （n=12）. The MI model was established by ligation the left anterior descending coronary artery （LAD），and rats in ME were subjected to 8 weeks treadmill exercise training. After training，cardiaorenal function was evaluated. The localization of AQP2 expression was determined by immunofluorescence staining. The levels of serum AVP and urine AQP2 were assessed by ELISA. The expression of renal AQP2，V2R and miR-21 was examined by RT-qPCR. The expression of renal SIRT1，Ac-NF-κBp65 and NF-κBp65 protein was examined by western blotting. Results：MI increased the expression of renal AVP，V2R and AQP2 and the level of urine AQP2，and then increased water reabsorption，thereby resulted in renal dysfunction. Compared with MI group，AIT obviously improved renal function and ameliorated the expression of renal AVP，V2R and AQP2 and the level of urine AQP2. Meanwhile，AIT up-regulated the expression of renal miR-21 and SIRT1，and inhibited the acetylation of NF-κBp65 in kidney of rats with MI. miR-21 expression was positively related to the expression of SIRT1. Conclusion：AIT up-regulates the expression of renal miR-21，activates miR-21/SIRT1/NF-κB signalling pathway，and then improve the renal function in rats after MI. The protective effect of AIT on renal function in MI rats was related to the increased expression of miR-21 and the activation of the miR-21/SIRT1/NF-κB signaling pathway.

myocardial infarction；aerobic interval training；renal function；miR-21；SIRT1/NF-κB；rats

G804.7

A

1000-677X（2017）07-0044-06

10. 16469/j. css. 201707006

2016-12-07；

2017-06-09

国家自然科学基金项目（31300978）。

林琴琴，女，副教授，硕士研究生导师，主要研究方向为运动心血管生物学，E-mail：linqinqin@ysu.edu.cn；耿元文，男，讲师，主要研究方向为运动心血管生物学，E-mail：gengyuanwen0407@ysu.edu.cn；田振军，男，教授，博士研究生导师，主要研究方向为运动心血管生物学，E-mail：tianzj611@hotmail.com。

1.燕山大学 体育学院，河北 秦皇岛 066004； 2. 陕西师范大学 体育学院暨运动生物学研究所，陕西 西安710119 1.Yanshan University，Qinhuangdao 066004，China；2. Shaanxi Normal University，Xi’an 710119，China.