中国西部某二级医院呼吸道感染住院患儿鼻咽部肺炎链球菌中常见非PCV13血清型菌株的横断面调查

文德年 刘 莹 史 伟 曾绍琦 曾海玲 唐 萍 黄小刚 姚开虎

·论著·

中国西部某二级医院呼吸道感染住院患儿鼻咽部肺炎链球菌中常见非PCV13血清型菌株的横断面调查

文德年1,4刘 莹2,4史 伟2曾绍琦1曾海玲3唐 萍3黄小刚1姚开虎2

目的 了解四川省中江县呼吸道感染住院患儿鼻咽部肺炎链球菌的定植状况及分离株的血清型分布和耐药性。方法 2015年1至12月采集四川省中江县人民医院儿科病房住院1月龄至14岁呼吸道感染患儿的鼻咽拭子并分离肺炎链球菌。用荚膜肿胀试验检测血清型，评估13价肺炎链球菌结合疫苗(PCV13)覆盖率。基于血清型随机选取约50%的菌株采用E-test法或纸片扩散法检测青霉素等16种抗生素的敏感性。结果 共采集到1 082例鼻咽拭子，分离到肺炎链球菌199株，携带率18.4%。常见血清型为19F(14.6%)、19A(10.6%)、34(10.1%)、6A(9.0%)、23F(7.5%)、6B(7.5%)和23A型(7.0%)。PCV13覆盖率为54.8%。分离株对静脉青霉素敏感，但对口服青霉素敏感率仅为9.1%，对阿莫西林-克拉维酸敏感率为97%，对头孢曲松、万古霉素、左氧氟沙星和利奈唑胺敏感率100%，对红霉素和阿奇霉素均耐药。结论 四川省中江县呼吸道感染患儿鼻咽部常有肺炎链球菌定植；分离株中非PCV13型别常见，以34和23A型为多，有必要加强监测；分离株对口服青霉素和红霉素等耐药率高，但对静脉青霉素、头孢曲松和万古霉素等普遍敏感。

肺炎链球菌； 携带率； 耐药性； 血清型； 儿童

肺炎链球菌是5岁以下儿童因肺炎死亡的重要原因[1]。WHO推荐各国尽快将肺炎链球菌结合疫苗(PCV)纳入儿童计划免疫[2]。对鼻咽部携带株和侵袭性分离株的调查均显示，我国北方地区肺炎链球菌分离株的7价PCV(PCV7，包含血清型为4、6B、9V、14、18C、19F和23F型)覆盖率明显低于南方，而2010年上市的PCV13(在PCV7基础上增加1、3、5、6A、7F和19A型)覆盖率在北方和南方相当，均超过80%[3,4]。但在既往报告中源于县区级医院的资料非常有限，对一线城市的研究结果是否具有全国范围的代表性受到质疑。本研究前期结果显示，四川省酉阳县常见血清型和疫苗覆盖率与既往大中型经济发达城市数据相似[5]。本文以文献[5]相同的方法在四川省中江县人民医院也开展了同样的横断面调查，结果明显不同于重庆市酉阳县人民医院的结果，现报告如下。

1 方法

1.1 研究对象 2015年1月至12月在四川省中江县人民医院儿科病房住院的临床诊断为呼吸道感染的儿童，均符合文献[5]的纳入标准和排除标准。

1.2 标本采集和保存 研究开始前，首都医科大学附属北京儿童医院(我院)微生物研究室资深技术员对四川省中江县人民医院儿科医护人员进行了统一技术培训。每例患儿在入院时经监护人同意后尽早采集鼻咽拭子。拭子操作、转运和孵育方法同文献[5]，孵育后-40℃冻存。分别于2015年6月和12月底转运至我院微生物研究室进行细菌分离培养。

1.3 细菌分离、培养和鉴定 操作程序见文献[5]。

1.4 血清分型 分型血清购自丹麦国家血清研究所，本研究中可确定已知的92种型别。操作步骤和判断标准按文献[6]进行。

1.5 抗生素敏感性检测 肺炎链球菌血清型与抗生素敏感性相关[7,8]，因此，本研究在血清型鉴定完毕后，采用随机数字法从中随机选取一半菌株进行抗生素敏感性检测。随机选取方案和检测抗生素的方法和种类见文献[5]。质控菌株为肺炎链球菌ATCC49619，药敏结果判定依据2016年美国临床和实验室标准化协会(CLSI)标准进行[9]。如果菌株对≥3种抗生素耐药，定义为多重耐药肺炎链球菌(MDRSP)。

1.6 观察指标截取和汇总 以患儿年龄和鼻咽拭子采集时间、细菌分离培养结果以及分离菌株血清型和抗生素敏感性结果进入后续分析，截取以下资料行描述性分析，①标本采集时季节和患儿年龄；②肺炎链球菌分离株的血清型分型；③抗生素药敏试验结果；按PCV13覆盖和非覆盖菌株不同血清型分层分析。

1.7 统计学分析 采用WHONET 5.6软件录入肺炎链球菌血清型和抗生素敏感性检测数据，并进行敏感性分析。采用SPSS 16.0统计软件进行统计学分析。计数资料用%表示，组间比较采用χ2检验或Fisher精确概率法。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 携带率 研究期间共收集到鼻咽拭子标本1 082份，其中男642例，女440例，年龄为1个月至14岁。肺炎链球菌携带率18.4%(199/1 082)。图1显示，1～10岁呼吸道感染儿童鼻咽部肺炎链球菌携带率随年龄增加总体呈现下降趋势，～2岁组携带率最高(27.4%)，≥10岁组携带率最低(3.3%)。图2显示，1年中肺炎链球菌分离阳性率呈“V”型分布，1～3月和11～12月阳性率高(>20.0%)；4月始阳性率逐渐降低，7月最低(7.3%)，之后逐渐升高。

图1 不同年龄组呼吸道感染儿童鼻咽部肺炎链球菌分离状况

图2 不同月份呼吸道感染儿童鼻咽部肺炎链球菌分离状况

2.2 血清型分布 在199株肺炎链球菌中，有7种血清型构成比超过5%，依次为19F[29株(14.6%)]、19A[21株(10.6%)]、34[20株(10.1%)]、6A[18株(9.1%)] 23F[15株(7.5%)]、6B[15株(7.5%)]和23A型[14株(7.0%)]。其余33.5%的菌株分属于其他21种血清型，分别为14(9株，4.5%)、15B(8株，4.0%)、10A(6株，3.0%)、15A(6株，3.0%)、15C(6株，3.0%)、42(5株，2.5%)、35B(5株，2.5%)、16F(4株，2.0%)、20(3株，1.5%)、6C(3株，1.5%)、13型(2株，1.0%)以及3、31、33、36、48、10B、18F、24F、7C、9V型各1株。

PCV13的覆盖率为54.8%(109/199)，非PCV13覆盖血清型有90株，包括常见血清型中的34和23A型。23价荚膜多糖疫苗(PPV23，包含1、2、3、4、5、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和33F型)的覆盖率54.3%(108/199)。

2.3 抗生素敏感性检测 在199株肺炎链球菌株中随机选取99株行16种抗生素敏感性检测。表1显示，所有菌株对静脉青霉素、头孢曲松、万古霉素、左氧氟沙星和利奈唑胺均敏感，阿莫西林-克拉维酸、氯霉素和泰利霉素敏感率分别为78.8%、83.8%和97.0%，口服青霉素敏感率9.1%，中介率90.9%；对红霉素、阿奇霉素均耐药，四环素和磺胺甲噁唑-甲氧苄啶耐药率分别为98.0%和85.9%。

2.4 PCV13覆盖菌株与非PCV13覆盖菌株的抗生素不敏感率比较 表2显示，PCV13覆盖菌株对口服青霉素、阿莫西林-克拉维酸、头孢吡肟、头孢呋辛和亚胺培南的不敏感率高于非PCV13 覆盖菌株(P<0.05)。

表1 99株肺炎链球菌对16种抗生素的敏感性

注 1)MIC50和90为抑制50%和90%细菌生长的最低药物浓度；2)均采用非脑膜炎分离株青霉素敏感性判定标准(mg·L-1)，静脉青霉素：敏感 ≤2 ，中介4，耐药≥8；口服青霉素：敏感≤0.064，中介0.12～2，耐药≥2；“-”表示美国临床和实验室标准化协会标准中未对相应折点做出规定

2.5 不同血清型菌株对β-内酰胺类抗生素的敏感性差异 表3显示，分离菌株中构成比>5%的7种常见血清型菌株对口服青霉素的中介率高于其他不常见血清型菌株，但从其他几种抗生素的中介率、耐药率和MIC值来看，19F、19A和23F型的耐药性相对较强，尤其是19F型。值得注意的是，34和23A型菌株的耐药性虽然相对较弱，但从MIC50、MIC90和最大MIC值来看，已经具有与19F和19A型耐药水平相似的菌株，在其他少见血清型中也发现了这样的菌株。

表2 PCV13、非PCV13覆盖菌株抗生素不敏感(中介+耐药)率比较[n(%)]

表3 不同血清型肺炎链球菌对β-内酰胺类抗生素耐药性差异

注 MIC为最低抑菌浓度，单位为mg·L-1，本研究中未分离到口服青霉素、阿莫西林-克拉维酸、头孢吡肟和亚胺培南耐药株

3 讨论

本研究显示，四川省中江县呼吸道感染儿童肺炎链球菌携带率为18.4%，略低于北京市和重庆市报道的23.6%[10]和22.6%[11]，更低于重庆市酉阳县的25.3%[5]。可能相关因素：①鼻咽拭子标本在四川中江县保存于-40℃，影响细菌存活率。②携带率与调查对象年龄段的构成有关[12]，因为不同地区儿童入托和生活方式的差异，不同年龄段的肺炎链球菌携带率有差异，如本研究中2岁组携带率最高(27.4%)，而北京市4岁组最高(38.6%)[10]。

本研究分离株的血清型分布与既往相似人群的报告数据[5,7,13～17](构成比>5%的血清型)有明显差异(表4)。尤其与同期进行的重庆市酉阳县研究比较也有明显不同。重庆市酉阳分离株中，构成比超过5%的血清型都是PCV13覆盖型别，PCV13覆盖率达73.8%。本研究PCV13覆盖率仅54.8%，非PCV13型达45.2%；两种非PCV13血清型34和23A型的构成比分别为10.1%和7.0%，明显高于重庆市酉阳县的1.1%和3.0%；34型在构成比排序中位列第三。产生上述差异的原因可能与下列因素有关。①免疫选择压力：疫苗推广应用后，群体对疫苗血清型产生免疫力，非疫苗血清型增多[18]。虽然四川省中江县和重庆市酉阳县均未使用过PCV7，但两地都有儿童接种PPV23的状况，可能影响肺炎链球菌的血清型分布。②抗生素选择压力：既往研究显示，细菌耐药性与血清型存在紧密联系，抗生素选择耐药菌时也影响血清型构成[7]。酉阳分离株对口服青霉素、阿莫西林-克拉微酸和头孢呋辛的耐药率为1.5%、2.2%和61.8%，均高于中江分离株(0、0和45.4%)，提示两地抗生素选择压力程度有所不同，筛选不同程度耐药株时血清型分布也受到了影响。本研究中非PCV13覆盖血清型中已有部分菌株对青霉素和头孢菌素等不敏感，将来推广接种PCV13，同时抗生素选择压力持续存在，这些耐药型别就有了广泛传播的有利条件。③患儿临床疾病严重程度：北京儿童医院曾监测同时期门诊呼吸道感染患儿鼻咽部[10]与住院部非侵袭性菌株(主要是呼吸道分离株)的[17]血清型分布，结果显示两组菌株的血清型分布有较大的差异(表4)，提示患儿临床情况的差异可能也是血清型调查结果出现差异的影响因素之一。

表4 本研究与国内其他地区儿童呼吸道标本分离肺炎链球菌血清型分布状况的比较

注 PCV13：13价肺炎链球菌结合疫苗；RI：呼吸道感染；IPD：侵袭性肺炎链球菌疾病；NR：未报告；1)：研究中某些型别只明确到群，未确定型；2)：研究中166份标本的分类统计，其中80份为成人标本。3)：包括107份呼吸道吸取物、56份支气管灌洗液和1份鼻咽拭子。4)：报告中评估PCV7覆盖率为67.4%

非疫苗血清型的传播流行对疫苗接种的效果有负面影响，尤其在已经具有一定程度流行的情况下，可能很快取代疫苗型别，成为致病主要群体，抵消疫苗免疫带来的益处[18]。认识和评估这些非疫苗血清型流行状况对于研发适合中国国情的新疫苗尤为重要。因此，有必要对四川省中江县及其周边地区开展调查，明确这些非PCV13血清型的播散范围、流行程度，和可能原因，为制定防控策略参考。

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(本文编辑：张崇凡，孙晋枫)

Thenon-PCV13serotypeswerefrequentamongStreptococcuspneumoniaeisolatedfromnasopharyngealsamplesofhospitalizedchildrenwithrespiratoryinfectioninagradetwohospitalinwesternChina

WENDe-nian1,4,LIUYing2,4,SHIWei2,ZENGShao-qi1,ZENGHai-ling3,TANGPing3,HUANGXiao-gang1,YAOKai-hu2

(1Departmentofclinicallaboratory,People'sHospitalofZhongjiangCounty,Deyang618100,China; 2BeijingKeyLaboratoryofPediatricRespiratoryInfectionDiseases,KeyLaboratoryofMajorDiseasesinChildren,MinistryofEducation,NationalClinicalResearchCenterforRespiratoryDiseases,NationalKeyDisciplineofPediatrics(CapitalMedicalUniversity),BeijingPediatricResearchInstitute,BeijingChildren’sHospital,CapitalMedicalUniversity,NationalCenterforChildren’sHealth,Beijing100045,China; 3DepartmentofPediatrics,People'sHospitalofZhongjiangCounty,Deyang618100,China; 4Co-firstauthor)

Corresponding Author：YAO Kai-hu, E-mail: jiuhu2655@sina.com

ObjectiveTo investigate the carriage rate, serotype distribution and antibiotic resistance profiles of Streptococcus pneumoniae (S.pneumoniae) among hospitalized children with respiratory tract infections in grade two hospital in Zhongjiang County, Sichuan and to determine the epidemiological characters of these S.pneumoniae isolates. MethodsNasopharyngeal swabs of hospitalized children with respiratory tract infections aged from 1 month to 14 years were collected from January to December 2015 at the Zhongjiang County Hospital, and S.pneumoniae was cultured. The serotypes were detected by capsule swelling experiment to assess the coverage rate of 13-valent pneumococcal conjugate vaccine (PCV13). The sensitivity against 16 antimicrobial agents were detected by E-test or disk diffusion method for approximately half of S.pneumoniae isolates randomly selected based on the serotypes.ResultsThe nasopharyngeal carriage rate of S.pneumoniae was 18.4% (199/1082). The common serotypes were 19F (14.6%), 19A (10.6%), 34 (10.1%), 6A (9.0%), 23F (7.5%), 6B (7.5%) and 23A(7.0%). The coverage rate of PCV13 was 54.8%. The proportion of non-PCV13 types was up to 45.2%. All of the isolates were sensitive to penicillin using the parenteral breakpoints, but the sensitive rate decreased to 9.1% for the oral penicillin breakpoints. The sensitivity rate of amoxycillin/clavulanate was 97%. All of the isolates were sensitive to ceftriaxone, vancomycin, levofloxacin and linezolid. However, all of the isolates were resistant to erythromycin and azithromycin.ConclusionColonization of S.pneumoniae was frequent in the nasopharynx of children with respiratory tract infections in Zhongjiang. About half of the S.pneumoniae isolates were identified as the PCV13 types. Non-PCV13 serotypes were common in the county, in which type 34 and 23A were frequent, which should be monitored for long time and in wider range. The isolates showed a high resistance to oral penicillin and erythromycin, but sensitive to parenteral penicillin, ceftriaxone and vancomycin.

Streptococcus pneumoniae; Carriage rate; Antibiotic resistance; Serotype distribution; Children

1 国家自然科学基金：81371853；2 国家科学技术部项目：2013BAI09B11；3 北京市科委行业定额经费自主项目：2016-bjsekyjs-3

1 四川省中江县人民医院儿科 德阳，618100；2 国家儿童医学中心，首都医科大学附属北京儿童医院，北京市儿科研究所，儿科学国家重点学科，国家呼吸系统疾病临床医学研究中心，教育部儿科重大疾病研究重点实验室，儿童呼吸道感染性疾病研究北京市重点实验室 北京，100045；3 四川省中江县人民医院检验科 德阳，618100；4 共同第一作者

姚开虎，E-mail:jiuhu2655@sina.com

10.3969/j.issn.1673-5501.2017.03.005

2017-05-22

2017-06-16)