肝细胞癌组织中CD163的表达及其与血管、淋巴管生成的关系*

范奇超，范丽玲，杨剑鑫，林扬元，谢 群#

1)莆田学院临床医学院临床医学系 福建莆田 351100 2)莆田学院基础医学院人体解剖学与组胚学教研室 福建莆田 351100

肝细胞癌组织中CD163的表达及其与血管、淋巴管生成的关系*

范奇超1)，范丽玲1)，杨剑鑫1)，林扬元2)，谢 群2)#

1)莆田学院临床医学院临床医学系 福建莆田 351100 2)莆田学院基础医学院人体解剖学与组胚学教研室 福建莆田 351100

#通信作者，女，1974年5月生，博士，教授，研究方向：肿瘤分子机制，E-mail：xqptu@163.com

CD163蛋白；CD34；D2-40；肝细胞癌；巨噬细胞

目的：探讨CD163蛋白在原发性肝细胞癌(HCC)中的表达特点。方法：收集HCC及癌旁组织各50例，通过免疫组化法检测HCC组织及癌旁组织中CD163、CD68蛋白的表达，利用CD34、D2-40标记血管、淋巴管生成情况，分析CD163、CD68蛋白的表达及其与病理学特征、血管和淋巴管生成等的关系。结果：癌组织中CD163蛋白的表达高于癌旁组织，CD68蛋白的表达低于癌旁组织(P均<0.001)；癌组织中CD163蛋白的表达在巨噬细胞占86.84%，13.16%表达在癌细胞；巨噬细胞中CD163蛋白的表达与肝硬化和Edmondson分级有关(P<0.05)；巨噬细胞中CD163蛋白高表达组的MVD及LMVD均高于低表达组(P均<0.001)。结论：CD163蛋白主要表达于巨噬细胞中，且与HCC的进展及血管和淋巴管生成有关。

在肿瘤的发生发展中，募集到癌变部位的巨噬细胞称之为肿瘤相关巨噬细胞(tumor associated macrophages，TAM)，是构成肿瘤微环境的重要成分，许多研究[1-3]指出TAM与胃癌、食管癌、直肠癌等多种肿瘤的血管、淋巴管的生成以及侵袭、转移密切相关。CD163是一类相对分子质量为130 000的跨膜蛋白，主要表达在人类单核细胞和巨噬细胞。巨噬细胞在不同的肿瘤微环境中出现两种不同的活化表型：经典活化型(M1型)和替代性活化型(M2型)。目前的研究[4]多用CD163标记M2型巨噬细胞，而认为CD68阳性表达的是泛巨噬细胞，且发现CD163和CD68阳性细胞在多种肿瘤组织中的浸润明显强于癌旁组织或正常组织，且浸润程度与肿瘤的分化、预后紧密相关。然而，肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)组织中CD68和CD163蛋白的表达趋势却与其他肿瘤不尽相同，比如HCC组织中CD68蛋白的表达低于癌旁组织，而对于CD163蛋白表达的研究则出现一些不同的结果[5]。为了更加明确了解CD163蛋白在HCC组织中的表达情况及其作用机制，作者进行了如下研究。

1 对象与方法

1.1 临床资料 收集2011年3月至2013年8月在莆田学院附属医院经手术切除、常规福尔马林固定、石蜡包埋并经病理确诊的HCC癌组织标本50例，同时获取相应的癌旁组织50例。其中男40例，女10例；年龄35～69岁，中位年龄48岁；肿瘤直径1.5～13.0(5.2±2.2)cm；根据Edmondson分级：Ⅰ、Ⅱ级23例，Ⅲ、Ⅳ级27例。

1.2 主要试剂 鼠抗人单克隆抗体CD34(MAB-0034)、CD163(MAB-0206)、CD68(MAB-0041)、D2-40(MAB-0567)、即用型免疫组化染色试剂盒(KIT-9921)、SP超敏试剂盒(KIT-9710)及DAB试剂盒均为福州迈新生物技术开发有限公司产品。

1.3 CD34、CD163、CD68和D2-40蛋白表达的免疫组化检测 CD34按照SP试剂盒说明进行染色，CD163、CD68和D2-40则按照HRP两步法进行染色。石蜡标本进行常规切片、梯度乙醇脱水、脱蜡、柠檬酸高压抗原修复、体积分数3%过氧化氢阻断内源性过氧化物酶及血清封闭后，滴加相应一抗，4 ℃孵育过夜，SP法滴加链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶室温孵育，HRP两步法则加入放大剂并滴加多聚酶结合物。所有切片均进行DAB显色，苏木精复染后中性树胶封片，置显微镜下观察。

1.4 结果判断 CD163、CD68染色结果判定：胞浆内若出现黄褐色或棕褐色颗粒即为阳性细胞。选取5个不重叠的视野，在高倍视野下进行观察并计数，计算阳性细胞平均数。CD163蛋白阳性表达的细胞有两种：一是阳性细胞呈纺锤形或星形，附着于癌组织的血窦内或癌旁组织肝血窦以及间质里的巨噬细胞；另有一部分阳性表达出现在肝癌细胞里；而CD68不论是在癌组织还是癌旁组织中，阳性表达的均为泛巨噬细胞。

D2-40、CD34 染色结果判定：CD34阳性表达为血管内皮细胞胞浆呈棕黄色显色，D2-40阳性表达为淋巴内皮细胞胞浆呈棕黄色。CD34阳性判断参照Weidner等[6]方法，先在低倍视野内初步筛选肿瘤组织内高血管密度区，然后在高倍视野下分别选择5个高血管密度区计数微血管数目，最后求其平均值作为该患者的微血管密度(micro-vascular density，MVD)。D2-40阳性判断参照Choi等[7]方法，先低倍镜下寻找淋巴管密度高的区域，然后在高倍镜下分别选择4个高密度区计数淋巴管数目，取其平均数作为微淋巴管密度(lymphatic vessel density，LMVD)。

1.5 统计学处理 采用SPSS 18.0进行分析，应用配对t检验比较HCC及癌旁组织中CD163和CD68蛋白表达的差异，应用两独立样本的t检验比较不同临床病理特征的HCC组织中CD163阳性表达的巨噬细胞、MVD和LMVD的差异，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 HCC及癌旁组织中CD163、CD68蛋白表达及MVD和LMVD的比较 见图1。其中，癌组织中CD163阳性表达位于巨噬细胞的占86.84%，表达位于癌细胞的占13.16%。在癌组织中，CD68蛋白表达低于CD163蛋白(t=12.464，P<0.001)；在癌旁组织中，CD68蛋白表达高于CD163(t=7.043，P<0.001)。HCC癌组织和癌旁组织中MVD和LMVD的表达情况见表1。

表1 HCC及癌旁组织中CD163蛋白、CD68蛋白、MVD和LMVD的表达 个/高倍视野

2.2 不同病理学特征的HCC组织中CD163阳性表达的巨噬细胞、MVD和LMVD的比较 见表2。

2.3 不同级别CD163阳性表达巨噬细胞的HCC组织中MVD和LMVD的表达 巨噬细胞CD163阳性表达计数的中位值为37，据此中位值将50例HCC分成低表达组(26例)和高表达组(24例)。比较2组中MVD及LMVD的分布，结果见图2、表3。

A：低表达组MVD； B：高表达组MVD；C：低表达组LMVD；D：高表达组LMVD。图2 不同级别CD163阳性表达巨噬细胞的HCC组织中MVD和LMVD(SP，×400)

表3 不同级别CD163阳性表达巨噬细胞的HCC组织中MVD和LMVD的表达 个/高倍视野

3 讨论

CD163是富含半胱氨酸清道夫受体超家族一员，主要表达在单核/巨噬细胞系。有学者[4]认为CD163是M2型巨噬细胞的表型标记物，而CD68是泛巨噬细胞的标记物。胃癌、食管癌等肿瘤组织中巨噬细胞CD68和CD163蛋白的表达均高于癌旁组织或非癌正常组织[8-9]。研究[10]表明HCC等肿瘤组织的CD68、CD163蛋白的表达出现异质性变化，并认为癌细胞与巨噬细胞之间的相互作用可能是导致这种现象的主要原因之一。

该研究发现HCC癌旁组织中CD68蛋白主要表达在血窦中，而HCC癌组织中CD68蛋白主要表达分布在癌巢周围血窦，少量在间质组织中，且其表达低于癌旁组织，可能与HCC组织中血窦发生融合和破坏而导致CD68蛋白阳性细胞数少于癌旁组织有关，这与之前的同类报道[11]类似。进一步分析HCC癌组织中CD163蛋白的表达情况，结果显示癌组织中CD163蛋白表达明显高于癌旁组织；同时对比CD163和CD68蛋白的表达情况，发现在癌组织中，CD163蛋白表达明显高于CD68，而癌旁组织中CD163蛋白表达却低于CD68，这与之前的一些报道有些不同：Kong等[5]研究发现肝癌组织中CD163和CD68蛋白的表达均低于癌旁组织，且CD163蛋白表达无论在肝癌组织还是癌旁组织中均高于CD68的表达，从而认为CD163蛋白并不能很好地反映肿瘤的分化及预后。为了探究其中原因，作者对CD163蛋白表达所在的细胞及其形态与分布位置进行观察分析，结果显示癌巢中血窦和间质里分布着许多形态不规则染色较深的巨噬细胞，占到CD163蛋白表达总阳性率的86.84%，同时还发现在癌巢中的部分癌细胞也出现CD163蛋白的表达，甚至出现一些阳性细胞形态很大且极不规则，但可见异型性明显的肿瘤细胞核，推测可能出现巨噬细胞与癌细胞的融合现象，这部分细胞占CD163蛋白总阳性率的13.16%，这可能就是癌组织中CD163蛋白表达高于CD68的重要原因之一。Shabo等[12-13]在脑胶质细胞瘤、结肠癌等组织中也发现CD163蛋白表达异常，提出了肿瘤细胞与巨噬细胞发生融合现象，肿瘤细胞表现为巨噬细胞抗原表型而出现CD163蛋白表达，且与肿瘤的分化、低生存期和肿瘤细胞增殖紧密相关。作者进一步探讨巨噬细胞CD163蛋白表达与HCC病理学特征的关系，发现巨噬细胞CD163蛋白表达与HCC的肝硬化程度和分化关系密切，由于HCC的进展常常伴随着肝炎-肝硬化-肝癌这一慢性进程，巨噬细胞可能参与HCC的发生发展，并对HCC侵袭程度具有一定的影响。

巨噬细胞是肿瘤微环境中重要的组成部分，其与肿瘤细胞之间的相互作用机制非常复杂，除了上述融合现象之外，还与肿瘤微血管、淋巴管形成密切相关[14]。该研究根据CD163蛋白在HCC巨噬细胞的表达中位值将HCC组织标本分为高表达组和低表达组，结果显示CD163蛋白高表达组MVD和LMVD均高于低表达组，提示巨噬细胞CD163蛋白表达与HCC血管及淋巴管的生成密切相关，可能通过调控血管及淋巴管生成参与HCC的发生发展。但巨噬细胞CD163蛋白阳性表达与MVD及LMVD之间的相互作用机制还有待进一步研究。

综上所述，HCC组织中CD163蛋白主要表达于巨噬细胞中，且其表达参与HCC的进展及血管和淋巴管生成；HCC组织中还出现巨噬细胞与癌细胞融合现象。探讨癌细胞与巨噬细胞融合现象、CD163等巨噬细胞表型标记物在癌细胞中的表达与肿瘤发生发展的关系将是后续有意义的尝试。

[1]韩伟,王正彩,周敏,等.TAMs在贲门癌和非贲门癌组织中的表达及其临床意义[J].现代生物医学进展,2013,13(31):6073

[2]冯稳.肿瘤相关巨噬细胞与食管鳞癌浸润、转移及脉管生成的关系研究[D].郑州:郑州大学,2012.

[3]袁娜娜，卢高峰，唐芙爱.人结直肠癌组织中肿瘤相关巨噬细胞的检测[J].郑州大学学报(医学版),2013,48(1):106

[4]HE KF,ZHANG L,HUANG CF,et al.CD163+tumor-associated macrophages correlated with poor prognosis and cancer stem cells in oral squamous cell carcinoma[J].Biomed Res Int,2014:838632

[5]KONG LQ,ZHU XD,XU HX,et al.The clinical significance of the CD163+and CD68+macrophages in patients with hepatocellular carcinoma[J].PLoS One,2013,8(3):e59771

[6]WEIDNER N,SEMPLE JP,WELCH WR,et al.Tumor angiogenesis and metastasis--correlation in invasive breast carcinoma [J].N Engl J Med,1991,324(1):1

[7]CHOI WW, LEWIS MM, LAWSON D,et al.Angiogenic and lymphangiogenic microvessel density in breast carcinoma: correlation with clinicopathologic parameters and VEGF-family gene expression[J].Mod Pathol,2005,18(1):143

[8]张志斌,朱艳,席俊峰.CD68+、CD163+巨噬细胞对食管癌浸润及预后的影响[J].现代中西医结合杂志,2015,24(6):590

[9]楼亚玲,丁玲,徐炜,等.HER2与CD163在胃癌中的表达及意义[J].实用肿瘤杂志,2016, 31(2):131

[10]NEWELL P, COTTAM B, SAVAGE T,et al.Circulating and intratumoral macrophages in patients with hepatocellular carcinoma:correlation with therapeutic approach[J].Am J Surg,2013,205(5):534

[11]DONG P, MA L, LIU L,et al.CD86+/CD206+,diametrically polarized tumor-associated macrophages,predict hepatocellular carcinoma patient prognosis[J].Int J Mol Sci,2016,17(3):320

[12]SHABO I, SVANVIK J.Expression of macrophage antigens by tumor cells[J].Adv Exp Med Biol,2011,714:141

[13]SHABO I, OLSSON H, ELKARIM R, et al.Macrophage infiltration in tumor stroma is related to tumor cell expression of CD163 in colorectal cancer[J].Cancer Microenviron,2014,7(1/2):61

[14]王晓龙,陈新涛,曲戈,等.M1型、M2型巨噬细胞及肿瘤相关巨噬细胞中miR-146a表达的差异[J].郑州大学学报(医学版),2015,50(2):225

(2016-11-02收稿 责任编辑赵秋民)

Relationship of CD163 expression in hepatocellular carcinoma and the microvascular density and lymphatic vessel density

FANQichao1)，FANLiling1)，YANGJianxin1)，LINYangyuan2)，XIEQun2)

1)DepartmentofClinicalMedicine，ClinicalMedicalSchool，PutianUniversity，Putian,Fujian351100 2)DepartmentofAnatomy，HistologyandEmbryology，SchoolofBasicMedicalSciences，PutianUniversity，Putian,Fujian351100

CD163 protein；CD34；D2-40；hepatocellular carcinoma；macrophage

Aim: To investigate the expression of CD163 protein in hepatocellular carcinoma(HCC). Methods: The expressions of CD163 and CD68 in 50 cases of primary HCC and matched peritumoral tissues were assessed by immunohistochemistry. CD34 and D2-40 were used to determine microvascular density(MVD) and lymphatic vessel density(LMVD), respectively. The relationship among CD163 expression with clinicopathological parameters, angiogenesis and lymphangiogenesis was analyzed. Results: The expression of CD163 in HCC tissue was significantly higher than that in peritumoral tissue(P<0.001), whereas the expression of CD68 in HCC tissue was significantly lower than that in peritumoral tissue(P<0.001). The positive expression rates of CD163 in macrophages and hepatoma cells accounted for 86.84% and 13.16%, respectively. The expression of CD163 in macrophages was related with hepatic cirrhosis and Edmondson grades(P<0.05). MVD and LMVD in high CD163-expression macrophage group were significantly higher than those in low CD163 expression macrophage group(P<0.001).Conclusion: The high expression of CD163 in macrophages may result in HCC progression, angiogenesis and lymphangiogenesis.

10.13705/j.issn.1671-6825.2017.04.016

*国家自然科学基金资助项目 81201670；福建省自然科学基金项目 2017J01546；莆田学院大学生创新创业训练计划 201511498007，201611498075，201611498008

R735.7