microRNA-509-3p对肝癌HepG2细胞增殖和侵袭能力的影响*

程豪为，杨荟玉，杨君霞，孙爱民，陈宏涛，杨小昂，巴秋菊

郑州大学医药科学研究院肝病研究室 郑州 450052

microRNA-509-3p对肝癌HepG2细胞增殖和侵袭能力的影响*

程豪为△，杨荟玉，杨君霞，孙爱民，陈宏涛，杨小昂，巴秋菊

郑州大学医药科学研究院肝病研究室 郑州 450052

△男，1962年6月生，本科，高级实验师，研究方向：肝病，E-mail:aiminsunzz@163.com

肝癌；HepG2细胞；微小RNA-509-3p；XIAP；细胞侵袭；增殖

目的：探讨微小RNA(miR)-509-3p对肝癌细胞增殖和侵袭能力的影响及其机制。 方法：选取60例肝癌患者癌组织及癌旁组织，采用实时荧光定量PCR法检测miR-509-3p的表达。培养HepG2细胞，分别转染miR-509-3p类似物和miR-509-3p抑制剂或X连锁凋亡抑制蛋白(XIAP)siRNA，以不进行任何处理的细胞为空白对照，利用CCK-8试剂及Transwell小室分别检测miR-509-3p表达对HepG2细胞增殖和侵袭能力的影响。结果：miR-509-3p在肝癌组织中的表达低于癌旁组织(P<0.001)。miR-509-3p类似物组细胞增殖能力和细胞侵袭数均低于空白对照组(P均<0.05)，miR-509-3p抑制剂组细胞侵袭数高于空白对照组(P<0.05)，miR-509-3p过表达可抑制XIAP的表达(P<0.05)。 结论：miR-509-3p表达对肝癌细胞的增殖和侵袭能力有抑制作用，其机制可能是miR-509-3p低表达促进XIAP上调从而促进肝癌细胞增殖、增加其侵袭能力。

肝癌是全世界最常见的恶性肿瘤之一，病死率高居全球第4位[1-2]。在我国，早期肝癌的发现率约为20%，发现时常为肝癌晚期或者因转移性肝癌而被发现[3]。目前，我国肝癌患者的治疗方案是以手术切除为主，但适合手术的患者并不多，而且花费较高，预后差。微小RNA(microRNA, 简称miR)是长20～24 nt的单链非编码RNA，研究[4]表明其主要参与转录后基因表达调控，包括细胞增殖、细胞周期、细胞凋亡、侵袭和转移等。近年来，越来越多的研究[5-7]表明miR-509-3p作为肿瘤抑制因子在多种类型的肿瘤发生过程中起作用，包括肾细胞癌、乳腺癌、急性淋巴细胞白血病、肺癌和肝癌。目前对肝癌机制方面的研究[8]已有大量报道，但是miR-509-3p在肝癌发生发展中所起的作用及其机制并没有文献报道。该研究采用实时荧光定量PCR检测肝癌组织中miR-509-3p的表达，分析其对肝细胞增殖和侵袭能力的影响；以人肝癌细胞株(HepG2)为研究对象，采用CCK-8 法检测miR-509-3p对HepG2细胞增殖的影响，应用Transwell细胞体外侵袭实验观察miR-509-3p对HepG2细胞侵袭能力的影响，以探讨miR-509-3p抗肝癌的可能机制。

1 材料与方法

1.1 标本及主要材料

1.1.1 组织标本 60例肝癌患者癌组织及癌旁组织均取自于2010年至2014年在郑州大学第一附属医院手术切取的标本，患者临床资料在医院病案室查得，术前均未接受过放、化疗治疗。该研究经郑州大学第一附属医院伦理委员会批准。患者对该研究均知情同意。

1.1.2 主要材料 肝癌细胞系HepG2购自中国科学院上海细胞研究所。胎牛血清(美国Gibco公司)，DMEM培养基(北京索莱宝科技有限公司)，miR-509-3p类似物和miR-509-3p抑制剂(上海吉玛公司)，脂质体 2000(美国Invitrogen公司)，Trizol试剂(大连宝生物公司)，miR探针(美国Applied Biosystems公司)，CCK-8(日本东仁化学公司)，Transwell小室(美国Corning公司)。

1.2 细胞培养 将HepG2细胞在37 ℃、体积分数5%CO2恒温培养箱中培养，培养基为含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养基。 根据转染物不同将细胞分为Ⅰ：空白对照组、miR-509-3p类似物组、miR-509-3p抑制剂组；Ⅱ：空白对照组、X连锁凋亡抑制蛋白(XIAP)siRNA组。采用脂质体 2000将miR-509-3p类似物和miR-509-3p抑制剂分别转染miR-509-3p类似物组和miR-509-3p抑制剂组细胞，48 h后消化收集细胞用于进一步分析。

1.3 实时荧光定量PCR法检测miR-509-3p的表达 根据操作说明书，采用Trizol试剂分离细胞和组织标本的总RNA。将miR-509-3p特异性引物经过逆转录之后以U6为内参通过miR探针法检测miR-509-3p的表达水平。反应体系：cDNA 2 μL，上、下游引物各0.8 μL，dNTP混合物200 μmol/L,Taq DNA聚合酶2.5 μL，加双蒸水至20 μL。反应条件：95 ℃ 30 s，90 ℃ 5 s，64 ℃ 34 s，连续进行42个循环。每组均设3个复孔。用2-ΔΔCt法计算miR-509-3p的相对表达量。

1.4 细胞增殖情况的CCK-8法检测 将细胞以每孔5 000个的密度接种到96孔板中，分别接种24、48、72、96、120 h后，每孔加入10 μL CCK-8试剂，置于培养箱中继续孵育2 h，然后用酶标仪在450 nm波长处测定吸光度值，表示细胞的增殖能力。每组设3个复孔。

1.5 Transwell细胞侵袭实验 培养HepG2细胞，分别转染miR-509-3p类似物和miR-509-3p抑制剂，以不进行任何处理的细胞为空白对照，将基底膜基质原液置于4 ℃冰箱过夜融化，将基底膜基质原液和预冷的无血清DMEM 按照体积比1：3的比例配制侵袭小室的上室凝胶液，每孔50 μL包被侵袭小室的上室，放置37 ℃孵育箱孵育2 h使其成胶。Transwell小室上室每孔接种200 μL不含血清细胞悬液，下室加入含10%胎牛血清的DMEM培养基500 μL。 将Transwell板置于培养箱中继续培养24 h后用结晶紫染色，显微镜下观察被染色细胞，取5个高倍视野并进行计数，结果取均值。实验重复3次。

1.6 统计学处理 采用SPSS 17.0进行统计学分析。miR-509-3p在肝癌和癌旁组织中表达情况的比较采用配对样本的t检验；不同组间细胞侵袭数的比较采用两独立样本的t检验或单因素方差分析和LSD-t检验；2组间细胞增殖能力的比较采用2×5析因设计的方差分析。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 miR-509-3p在肝癌和癌旁组织中的表达情况结果表明，与癌旁组织(1.074±0.017)比较，肝癌组织中miR-509-3p的相对表达量(0.327±0.021)下调(t配对=214.158，P<0.001)。

2.2 miR-509-3p过表达对细胞增殖的影响 结果见表1。由表1可知，miR-509-3p上调可抑制HepG2细胞的增殖，差异有统计学意义。

表1 miR-509-3p对肝癌细胞增殖的影响

F组间=47.446，P<0.001；F时间=253.215，P<0.001；F交互=217.577，P<0.001。

2.3 miR-509-3p对细胞侵袭能力的抑制作用 与空白对照组相比，miR-509-3p过度表达后可以降低细胞的侵袭能力，给予miR-509-3p抑制剂处理后，细胞的侵袭能力增加(表2)。

2.4 XIAP对肝癌细胞增殖和侵袭能力的影响 结果显示，XIAP基因沉默可以抑制细胞的增殖与迁移能力(表3)。

表2 miR-509-3p 对肝癌细胞侵袭能力的影响

F=103.145，P<0.001；组间两两比较，P均<0.05。

表3 XIAP 对肝癌细胞增殖和侵袭能力的影响

*:F组间=33.115，P<0.001；F时间=212.756，P<0.001；F交互=118.866，P<0.001。#:t=197.368，P<0.001。

3 讨论

miR在各种生物学调节过程中发挥重要作用[9]，包括细胞增殖、细胞周期、细胞凋亡、侵袭和转移等。miR509-3p在多种肿瘤细胞中作为抑癌基因存在，但是其在肝癌组织及细胞中的表达情况并未见报道。该研究发现，与正常组织相比，miR-509-3p在肝癌组织中表达下调。此外，作者还发现miR-509-3p过表达可以抑制肝癌细胞的增殖，抑制肝癌细胞迁移能力，miR-509-3p低表达可增加肝癌细胞迁移能力。这些证据表明miR-509-3p的低表达可能与肝癌的发生有关。

由于XIAP与癌细胞对凋亡的敏感性密切相关，因此是恶性肿瘤预后重要的生物标志物[10]。XIAP在大部分肿瘤组织中都呈高表达，XIAP表达增高提示肿瘤患者预后较差，生存率降低[11-12]。 该研究中作者发现，miR-509-3p和XIAP在细胞增殖和转移中发挥相反的功能，提示XIAP可能成为肝细胞中miR-509-3p的功能性靶基因。因而XIAP可能是肝癌的一个潜在的分子靶点，二者联合有望成为肝癌分子靶向治疗的一个新的发展方向。

总之，该研究证实了与癌旁组织相比，miR-509-3p在肝癌组织中表达下调。XIAP是miR-509-3p调控的下游靶基因，而且miR-509-3p对XIAP起负调节作用。加之，miR-509-3p被认为是一个肿瘤抑制基因，在肝癌中可能通过调节靶基因XIAP来阻止细胞的增殖和浸润，这为肿瘤的基因治疗提供了新视角，同时为肝癌靶向治疗的发展提供了基础。

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(2016-12-09收稿 责任编辑姜春霞)

Effects of microRNA-509-3p on proliferation and invasiveness of liver carcinoma HepG2 cells

CHENGHaowei,YANGHuiyu,YANGJunxia,SUNAimin,CHENHongtao,YANGXiao′ang,BAQiuju

DepartmentofLiverDisease,InstituteofMedicalandPharmaceuticalSciences,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052

liver carcinoma;HepG2 cell;microRNA-509-3p;XIAP;cell invasion;proliferation

Aim: To explore the role of microRNA(miR)-509-3p in proliferation and invasion of liver carcinoma cells. Methods: A total of 60 cases of liver carcinoma tissue and 60 cases of paracancerous tissue were selected, and the miR-509-3p expression was detected by real-time PCR.HepG2 cells were cultured and transfected with miR-509-3p mimic, miR-509-3p inhibitor or XIAP siRNA, and cells without any treatment were the control group.The cell proliferation activity was detected by CCK-8, and cell invasion was detected by Transwell cell migration assay.Results: The expression of miR-509-3p in liver carcinoma tissue was significantly lower than that in paracancerous tissue(P<0.001).Compared with the control group, the cell proliferation rate and the number of migration cells in miR-509-3p mimic group were significant lower(P<0.05), while those in miR-509-3p inhibitor group were higher(P<0.05),and miR-509-3p overexpression contributed to the inhibition of XIAP expression(P<0.05).Conclusion: miR-509-3p plays an important role in the development and progression of liver carcinoma, and its downregulation of miR-509-3p may be closely associated with the high expression of XIAP.

10.13705/j.issn.1671-6825.2017.04.009

*河南省基础与前沿项目 142300410326

R735.7