高效液相色谱法测定人血浆和胸水中洛铂的质量浓度

王秀刚，高梅梅，耿春梅，袁桂艳，王本杰，郭瑞臣#

(1.山东省青州荣军医院药剂科，山东 青州 262500； 2.山东大学齐鲁医院临床药理研究所，山东 济南 250012)

高效液相色谱法测定人血浆和胸水中洛铂的质量浓度

王秀刚1*，高梅梅2，耿春梅2，袁桂艳2，王本杰2，郭瑞臣2#

(1.山东省青州荣军医院药剂科，山东 青州 262500； 2.山东大学齐鲁医院临床药理研究所，山东 济南 250012)

目的：建立同时测定人血浆、胸水中洛铂质量浓度的高效液相色谱法，并应用于肺癌患者，为临床治疗药物监测提供依据。方法：人血浆、胸水样品离心后，经乙腈蛋白沉淀，色谱柱为Inertsil-ODS-SP色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相为pH=6.5的磷酸盐缓冲液-乙腈(含0.03%三乙胺)(V∶V=96∶4)，流速为1.0 ml/min，于215 nm波长处进行检测。结果：胸水中洛铂质量浓度在0.1～80.0 μg/ml、血浆中洛铂质量浓度在0.1～50.0 μg/ml范围内呈现良好线性关系，洛铂在胸水、血浆中最低定量限和检测限分别为0.1、0.5 μg/ml。结论：本研究建立了快速测定人胸水、血浆中洛铂浓度的高效液相色谱法，该方法灵敏、稳定、重现性好、选择性好、准确度高，可用于准确测定人胸水、血浆中洛铂的含量，并用于治疗药物监测，有利于对患者进行个体化治疗。

洛铂； 治疗药物监测； 高效液相色谱法； 非对映异构体； 肺癌

洛铂即1，2-二氨基-环丁烷-乳酸合铂，是第3代铂类抗肿瘤药，其2种非对映异构体以约1∶1的比例同时存在，结构式见图1[1-2]。研究结果表明，与其他铂类抗肿瘤药比较，洛铂具有多项优势，如胃肠道不良反应小、水溶液性质稳定等[3-4]。洛铂与顺铂的作用机制相似，但毒副作用少，与其他铂类药物无交叉耐药性，且对顺铂耐药的肿瘤也有效，具有广阔的临床应用前景[5]。临床上，患者应用注射用洛铂后的体内药物浓度个体差异较大，因此，需要对其进行治疗药物监测。但是，目前关于对体内尤其是胸水中洛铂的质量浓度进行治疗药物监测的报道较少。本实验建立了快速、准确、灵敏地测定人血浆和胸水中洛铂浓度的方法，并成功用于肺癌患者应用注射用洛铂后的洛铂浓度监测。

图1 洛铂的2种非对映异构体结构式Fig 1 Chemical structures of two diastereoisomers of lobaplatin

1 材料

1.1 仪器

Agilent 1100型高效液相色谱仪，Agilent G1313A型自动进样器、G1314A型紫外检测器、LC系统化学工作站(美国安捷伦仪器公司)；XW-80A型旋涡混合器(上海精科实业有限公司)；ABOTT高速离心机(美国雅培公司)；PK514BP型超声清洗器(德国BANDELIN公司)；梅特勒-托利多AL-104型电子天平(梅特勒-托利多仪器上海有限公司)；梅特勒-托利多AX-205 Delta Range电子天平(瑞士梅特勒公司)；SBHW-Ⅳ型电热恒温水温箱(北京市医疗设备厂)。

1.2 药品与试剂

注射用洛铂(海南长安国际制药有限公司，批号：20150401，规格：50 mg/支)；乙腈(色谱纯，美国J.T.Baker公司，批号：0000096305)；磷酸二氢钾(分析纯，山东省化工研究院，批号：20110224)；氢氧化钠(分析纯，山东省化工研究院，批号：20150307)；哇哈哈饮用纯净水(杭州哇哈哈集团有限公司，批号：20160103)；空白血浆购自山东省血液中心，空白胸水由山东大学齐鲁医院呼吸科提供。参与研究的11例肺癌患者均签署知情同意书，研究方案经山东大学齐鲁医院伦理委员会讨论通过。

2 方法与结果

2.1 标准溶液的配制

称取洛铂标准品，用纯净水配制成质量浓度为1.0 mg/ml的标准储备液，保存于棕色瓶中。取适量标准储备液于棕色容量瓶中，用纯净水定容，分别配制成不同质量浓度(5、10、50、100、200、300、400、500、800 μg/ml)的标准溶液，用于建立标准工作曲线。将以上各溶液至于4 ℃冰箱冷藏保存，每3 d新配制1次。

2.2 样本的采集、保存

空白血浆购自山东省血液中心；肺癌患者来源于山东大学齐鲁医院呼吸内科，采集血样前采取胸腔给药途径，将注射用洛铂30 mg以注射用水5 ml溶解，加入5%葡萄糖溶液500 ml中。分别采集给药前及给药2、17 h后患者的胸水和全血样本，在5 000 r/min转速下离心5 min处理，于-80 ℃保存备测。

2.3 样本的处理、测定

色谱条件：色谱柱为Inertsil-ODS-SP色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相为pH=6.5的磷酸盐缓冲液-乙腈(含0.03%三乙胺)(V∶V=96∶4)，流速为1.0 ml/min，进样量为20 μl，检测波长为215 nm，柱温为室温(25 ℃)。取血浆/胸水样品200 μl，加入乙腈600 μl，涡旋，混匀3 min；在10 800 r/min转速下离心10 min，取上清液，37 ℃水浴下以N2恒速吹干；给予纯净水100 μl复溶，涡旋，混匀1 min，在10 800 r/min转速下离心5 min，取上清液20 μl进样分析；整个操作过程注意避光[6]。

2.4 专属性试验结果

洛铂的2种非对映异构体色谱图见图2。血浆和胸水中的杂质不影响洛铂测定，2种非对映异构体L-D1和L-D2的保留时间分别为22.550和23.906 min。

A.25 μg/ml的洛铂标准溶液；B.空白胸水；C.空白血浆；D.50 μg/ml的洛铂胸水样本；E.40 μg/ml的洛铂血浆样本A. 25 μg/ml lobaplatin standard solution；B.blank hydrothorax；C.blank plasma；D.50 μg/ml lobaplatin blank hydrothorax spiked；E.40 μg/ml lobaplatin blank plasma spiked图2 洛铂2种非对映异构体的色谱图Fig 2 Typical chromatograms of two diastereoisomers of lobaplatin

2.5 标准工作曲线、最低定量限及检测限

精密吸取不同质量浓度(5、10、50、100、200、300、500 μg/ml)洛铂储备液20 μl，分别加入至180 μl空白血浆中，配成质量浓度为0.5、1.0、5.0、10.0、20.0、30.0、50.0 μg/ml的血浆溶液[7]；同法配成质量浓度为0.5、1.0、5.0、10.0、25.0、40.0、80.0 μg/ml的胸水溶液，经乙腈蛋白沉淀后进样测定。洛铂质量浓度(X)与峰面积(Y)以外标法定量回归得到标准曲线方程，线性方程、线性范围、相关系数(R2)、最低定量限及检测限见表1。

2.6 提取回收率试验结果

取空白血浆和胸水，配制不同质量浓度的洛铂溶液，设定低、中、高质量浓度质控样本，经蛋白沉淀处理后进样测定，根据测定质量浓度与实际加入质量浓度计算提取回收率，结果见表2。

表1 胸水和血浆中洛铂2种非对映异构体的线性、最低定量限、检测限Tab 1 Linearity, LOQ and LOD of two diastereoisomers of lobaplatin in human hydrothorax and plasma

表2 胸水和血浆中洛铂2种非对映异构体的提取回收率(n=5)Tab 2 Recovery of two diastereoisomers of lobaplatin in human hydrothorax and plasma(n=5)

2.7 精密度试验结果

设定低、中、高质量浓度质控样本，按“2.3”项下方法处理，重复制备测定5次，计算日内精密度；然后每日制备并测定1次，连续3 d，计算日间精密度，结果见表3。

表3 胸水和血浆中洛铂2种非对映异构体的精密度、准确性(n=5)Tab 3 Intra-day and inter-day precision and accuracy for determination of two diastereoisomers of lobaplatin in human hydrothorax and plasma(n=5)

2.8 稳定性试验结果

分别配制低、中、高3个质量浓度的标准血浆、胸水溶液，分别于室温(25 ℃)放置7、14 h，-20 ℃冰箱放置2、7、14、30 d，冻融2次等避光保存，经蛋白沉淀提取，每个质量浓度平行衍生化5次，分别测定。结果显示，上述稳定性试验条件下，血浆、胸水中洛铂稳定，可以满足实际需要。

2.9 肺癌患者血浆和胸水中洛铂含量的测定

11例肺癌患者中，男性8例，女性3例；年龄33～72岁，平均(58.00±12.28)岁。按照“2.3”项下方法处理，给药2 h后某肺癌患者血浆、胸水中洛铂2种非对映异构体的色谱图见图3，给药2、17 h后11例肺癌患者胸水、血浆中洛铂2种非对映异构体的质量浓度测定结果见表4。

F.胸水；G.血浆F.hydrothorax；G.plasma图3 肺癌患者血浆、胸水中洛铂2种非对映异构体的色谱图Fig 3 Typical chromatograms of two diastereoisomers of lobaplatin in lung cancer patients

样本给药2h后给药17h后L⁃D1质量浓度L⁃D2质量浓度L⁃D1质量浓度L⁃D2质量浓度胸水6107±18876226±1724418±222344±107血浆548±184687±509367±249335±170

3 讨论

目前，已有洛铂体内浓度[6]、污染环境(水)[7]测定，以及非对映异构体[8]测定的文献报道，但未见同时测定洛铂2种非对映异构体的报道，亦未见用于胸水中洛铂质量浓度监测的研究，临床缺乏具有实际指导意义的实验依据。本研究建立了能够同时测定人血浆和胸水中洛铂2种非对映异构体的高效液相色谱法，该方法快速、稳定、高效、准确。血浆和胸水的处理采用沉淀蛋白法，以乙腈为蛋白沉淀剂，既经济、方便、血浆中杂质无干扰，又符合测定要求。

由于洛铂2种非对映异构体的分离受流动相pH的影响较大，本研究通过比较磷酸盐缓冲液与乙腈不同配比以及磷酸盐缓冲液不同pH对洛铂2种非对映异构体保留时间、峰形、血浆和胸水中其他杂质有无干扰等，确定流动相最佳配比和磷酸盐缓冲液的pH。该方法条件下，洛铂2种非对映异构体分离良好，保留时间适中，血浆和胸水中其他杂质无干扰。

本方法色谱条件下，可同时测定血浆和胸水中洛铂2种非对映异构体的质量浓度，操作简单、专属性好、灵敏度高，适用于常规治疗药物监测，利于患者进行个体化治疗。

[1]Li X，Ran L，Fang W，et al.Lobaplatin arrests cell cycle progression，induces apoptosis and alters the proteome in human cervical cancer cell Line CaSki[J].Biomed Pharmacother，2014，68(3)：291-297.

[2]Welink J，Pechstein B，van der Vijgh WJ.Determination of the two diastereoisomers of lobaplatin(D-19466) in plasma ultrafiltrate of cancer patients with a normal or an impaired kidney or liver function by high-performance liquid chromatography with ultraviolet detection[J].J Chromatogr B Biomed Appl，1996，675(1)：107-111.

[3]Dai HY，Liu L，Qin SK，et al.Lobaplatin suppresses proliferation and induces apoptosis in the human colorectal carcinoma cell Line LOVO in vitro[J].Biomed Pharmacother，2011，65(3)：137-141.

[4]Yu H，Tang Z，Zhang D，et al.Pharmacokinetics, biodistribution and in vivo efficacy of cisplatin loaded poly(L-glutamic acid)-g-methoxy poly(ethylene glycol) complex nanoparticles for tumor therapy[J].J Control Release，2015，205：89-97.

[5]Wu HT，Peng KW，Ji ZH，et al.Cytoreductive surgery plus hyperthermic intraperitoneal chemotherapy with lobaplatin and doce-taxel to treat synchro-nous peritoneal carcinomatosis from gastric cancer: Results from a Chinese center[J].Eur J Surg Oncol，2016，42(7)：1024-1034.

[8]Kahsay G，Song H，Eerdekens F，et al.Development and validation of LC methods for the separation of misoprostol related substances and diastereoisomers[J].J Pharm Biomed Anal，2015，111：91-99.

Mass Concentration of Lobaplatin in Human Plasma and Hydrothorax by HPLC

WANG Xiugang1，GAO Meimei2，GENG Chunmei2，YUAN Guiyan2，WANG Benjie2, GUO Ruichen2

(1.Dept.of Pharmacy, Qingzhou Rongjun Hospital of Shandong Province，Shandong Qingzhou 262500, China; 2.Institute of Clinical Pharmacology, Qilu Hospital of Shandong University,Shandong Jinan 250012, China)

OBJECTIVE：To establish the method for mass concentration of lobaplatin in human plasma and hydrothorax by HPLC. The method was used for patients with lung cancer, and could provide basis for the clinical therapeutic drug monitoring(TDM). METHODS: Human plasma and hydrothorax samples were centrifuged and extracted with acetonitrile. The Inertsil-ODS-SP column (250 mm×4.6 mm，5 μm) was used, the mobile phase were consisted of phosphate buffer (pH=6.5) and acetonitrile (containing 0.03% triethylamine)(V∶V=96∶4) and flushed at a flow rate of 1.0 ml/min，the wavelength was 215 nm. RESULTS: The calibration curves were linear over a concentration range of 0.1 μg/ml-80.0 μg/ml in the hydrothorax and 0.1 μg/ml-50.0 μg/ml in the plasma respectively. The limit of detection (LOD) and limit of quantification (LOQ) was 0.1 μg/ml and 0.5 μg/ml in hydrothorax and plasma. CONCLUSIONS: A rapid HPLC method to detect the concentration of lobaplatin in human plasma and hydrothorax was established. The method is sensitive, stable with good reproducibility, selectivity and high accuracy, and could be successfully used for the determination of lobaplatin concentration in human plasma and hydrothorax so as to conduct the therapeutic drug monitoring and provide individualized therapy for lung cancer patients.

Lobaplatin; Therapeutic drug monitoring; HPLC; Diastereoisomer; Lung cancer

R927.2

A

1672-2124(2017)05-0597-04

2017-03-13)

*副主任药师。研究方向：医院药学。E-mail：wangxiugang123@126.com

#通信作者：主任药师，教授，博士生导师。研究方向：临床药学和临床药理学。E-mail：grc7636@126.com

DOI 10.14009/j.issn.1672-2124.2017.05.008