高效液相色谱法检测苯甲酸阿格列汀对映异构体的含量

邱思婕，郭燕玲

（广东先强药业股份有限公司，广东 广州 510000）

苯甲酸阿格列汀（alogliptin benzoate）为丝氨酸蛋白酶二肽基肽酶Ⅳ（DPP-Ⅳ）抑制剂，化学名为（R）-2- ［（6- （3-氨基哌啶 -1-基）-3-甲基 -2，4-二氧代 -3，4-二氢嘧啶 -1（2H）-基）甲基］苄腈苯甲酸，2010年4月首次在日本获批上市［1-2］。该药分子中含有手性中心，因此有必要建立对映异构体的测定方法。为此，笔者建立了测定苯甲酸阿格列汀对映异构体的高效液相色谱法，方法准确可靠、简便、灵敏度高，现报道如下。

1 仪器与试药

Agilent1260型高效液相色谱仪（美国Agilent公司），BT125D型分析天平（德国赛多利斯公司）。苯甲酸阿格列汀对映异构体对照品（纯度为99%，批号为121101S），苯甲酸阿格列汀对照品（纯度为 99%，批号为 121101），苯甲酸阿格列汀（批号分别为121201，121202，121203）均由广东先强药业股份有限公司提供；正己烷、乙醇为色谱纯，二乙胺为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Chiralcel OJ-H 手性柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流动相：正己烷 -乙醇 -二乙胺（60∶40∶0.1）；检测波长：225 nm；流速：0.8mL /min；柱温：25 ℃ ；进样量：20 μL。

2.2 溶液制备

精密称取苯甲酸阿格列汀对映异构体适量，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，制成每1mL约含阿格列汀对映异构体50μg的溶液，即得对映异构体贮备液。

精密量取对映异构体贮备液适量，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，制成每1mL约含阿格列汀对映异构体0.5μg的溶液，即得对照品溶液。

精密称取苯甲酸阿格列汀适量，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，制成每1mL约含阿格列汀100μg的溶液，即得供试品溶液。

精密称取苯甲酸阿格列汀对照品和苯甲酸阿格列汀对映异构体对照品适量，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，制成每1mL约含阿格列汀及其对映异构体各20μg的溶液，即得系统适用性溶液。

2.3 方法学考察

系统适用性试验：精密吸取对照品溶液20μL注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使主成分色谱峰的峰高为满量程的10%～20% 。精密吸取系统适用性溶液20μL，注入液相色谱仪，记录色谱图。阿格列汀与对映异构体的保留时间约为12 min和19min，分离度大于2.0，理论板数均大于2 500。

检测限考察：精密量取对映异构体贮备液，按倍比稀释法稀释，取稀释后溶液，分别进样20μL，记录色谱图。按信噪比S/N＝3计算，检测限约为1.02 ng。

定量限考察：精密量取对映异构体贮备液，按倍比稀释法稀释，取稀释后溶液，分别进样20μL，记录色谱图。按信噪比S/N＝10计算，定量限约为3.06 ng。

线性关系考察：精密称取对映异构体对照品适量，加流动相溶解并稀释成含阿格列汀对映异构体0.15，0.30，0.50，0.60，0.75μg/mL的溶液，分别进样20μL，以进样质量浓度为横坐标、阿格列汀对映异构体峰面积为纵坐标进行线性回归，线性方程为 Y＝143.35X+0.297 9，r2＝0.999 7（n＝5）。结果表明，对映异构体质量浓度在0.15～0.75μg/mL范围内与峰面积呈良好线性关系。

准确度考察：取苯甲酸阿格列汀约13.6mg（未检出对映异构体），共9份，每3份分别加入对映异构体贮备液0.8，1.0，1.2mL，用流动相稀释至100mL，摇匀。分别进样20μL，以外标法计算加入量，结果见表1。

精密度试验：取对映异构体对照品溶液，进样6次，记录色谱图。结果对映异构体峰面积的 RSD＝0.5%（n＝6），表明仪器精密度良好。

2.4 样品检测

取3批供试品，照2.1项下的方法配制供试品溶液、对照品溶液。按2.2项下色谱条件进行测定，记录色谱图，按外标法计算对映异构体含量。3批供试品中均未检出对映异构体。

表1 准确度考察结果（n＝9）

3 讨论

色谱柱的选择：本试验采用2种色谱柱即Chiralpak IC和Chiralcel OJ-H手性柱对异构体进行拆分。结果显示，使用Chiralcel OJ-H手性柱时，保留时间较短，分离效果好，柱效较高，因此确定为本试验用色谱柱。该色谱柱的固定相为表面涂敷了手性多聚物（直链淀粉或纤维素衍生物）的球型硅胶，是目前通用性最广的正相手性色谱柱之一。

测定波长的选择：通过紫外光谱扫描，苯甲酸阿格列汀对映异构体在225 nm和277 nm波长处有最大吸收，但在277 nm波长处苯甲酸吸收较强，故测定波长定为225 nm。

流动相的选择：在试验过程中，通过调整正己烷-乙醇的比例，使阿格列汀与其对映异构体之间能达到分离要求。综合考虑分析时间、柱压、分离度等因素，最后确定为正己烷-乙醇（60∶40）。在此条件下，对二乙胺的浓度进行考察，结果表明二乙胺的浓度对分离几乎无影响，但可改善峰形、减小拖尾。因此，确定流动相为正己烷-乙醇-二乙胺（60∶40∶0.1）。

参考文献：

［1］王 珊，范 鸣 .抗 2型糖尿病药物-Alogliptin［J］.药学进展，2008，32（7）：326-327.

［2］张淑芳.治疗糖尿病的新药NESINA获批在日本上市［J］.中国执业药师，2010，12（6）：54.