微波辐射下以离子交联法制备壳聚糖微粒

宋 林， 年中峰， 杨 頔， 蒋福宇， 刘学贵

(1.沈阳化工大学 制药与生物工程学院, 辽宁 沈阳 110142; 2.东北制药集团股份有限公司， 辽宁 沈阳 110026)

微波辐射下以离子交联法制备壳聚糖微粒

宋 林1,2， 年中峰1， 杨 頔1， 蒋福宇1， 刘学贵1

(1.沈阳化工大学 制药与生物工程学院, 辽宁 沈阳 110142; 2.东北制药集团股份有限公司， 辽宁 沈阳 110026)

以壳聚糖作为载体材料，焦磷酸钠(TSPP)作为交联剂，在微波辐射下，采用离子交联法制备壳聚糖微粒.考察制备工艺对微粒粒径、形貌、分散度的影响.采用扫描电子显微镜、光学显微镜和红外光谱对微粒形貌和结构进行表征.结果表明微波辐射下制备壳聚糖微球的较佳工艺条件为：微波辐射下反应温度为60 ℃，交联时间为5 min，正负离子的摩尔比为30∶1，转速为400 r/min.

壳聚糖微球； 焦磷酸钠； 微波辐射法； 离子交联

甲壳素是一种纯天然可再生的自然资源，在自然界中广泛存在.壳聚糖是由甲壳素脱乙酰化反应得到的链状聚氨基多糖(1,4)-2-氨基-2-脱氧-β-D-葡聚糖,是仅少于纤维素的自然界第二大多糖,壳聚糖已被证实具有mm好的生物相容性、生物可降解性、抗菌活性、无毒性和保湿性能[1].因具有这些理想的性能，壳聚糖可以加工制作成支架、纳米粒、纳米纤维、微球、珠状体、薄膜等[2-7].壳聚糖也已被证实能提升不溶药物和难容药物的溶解性[8]，其带正电性和良好的生物黏附性使其在黏膜表面负电荷条件下黏附性增加，药物滞留时间延长，且壳聚糖分子内具有活性基团—NH2，可与含双官能团的醛或酸酐药物化学偶联，使药物大量分布于偶联结构内缓慢释放，用壳聚糖制备的微球作为药物载体明显优于一般材料，近年来受到有关研究者的广泛关注[9].因此，壳聚糖在制药应用方面具有很好的发展前景.

本文使用焦磷酸钠作为交联剂制备壳聚糖微粒，并用微波辐射法代替常规的水浴加热法，这种在微波辐射下，焦磷酸钠作为交联剂制备壳聚糖微球的方法在国内外研究中未见报道.本文以上述方法制备壳聚糖微粒，以微粒形貌为考察指标，以转速、交联时间、温度、交联剂的正负离子摩尔比为影响因素，对微球的制备工艺进行了考察.

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

壳聚糖，国药集团化学试剂有限公司，脱乙酰度为80.0 %～95.0 %，黏度为50～800 mPa·s，生化试剂；焦磷酸钠、氢氧化钠，分析纯，天津市博迪化工有限公司；无水乙醇、异丙醇，分析纯，天津市大茂化学试剂厂；冰醋酸，分析纯，国药集团化学试剂有限公司.

激光粒度分布仪，BT-9300H，丹东市百特仪器有限公司；冻干机，德国LYOVAC GT2-S；扫描电镜，SEM，SNE3200m，韩国SNE公司；紫外分光光度计，UV-3200PC，上海美谱达仪器有限公司；红外光谱仪，NEXUS470，美国热电公司；pH计，PHS-3C，上海精密科学仪器有限公司.

1.2 壳聚糖微粒的制备

称取定量的壳聚糖固体溶于50～100 mL体积分数为2 %～3 %的醋酸溶液中，制得质量分数为1 %～2 %的壳聚糖醋酸溶液，然后用循环水式真空泵抽滤除去壳聚糖中的杂质.在室温下，向壳聚糖醋酸溶液中滴加NaOH 溶液(1.0 mol/L)，用pH 计调节壳聚糖溶液的pH 在4～7的范围内，并在固定的温度(室温～100 ℃)、正负电荷摩尔比(20∶1～60∶1)、交联时间(5～25 min)、转速(300～700 r/min)的条件下，在微波反应器中设置好参数，将焦磷酸钠溶液(0.5～0.8 g/L)滴加到制备好的壳聚糖醋酸溶液中，并得到壳聚糖微粒溶液.反应结束后，将制备好的壳聚糖微粒溶液用台式低速自动离心机离心2～5 min(3 000～4 000 r/min)，倒去上层清液，然后用纯净水洗涤3～5次，最后将产物在-30～45 ℃的条件下冷冻干燥12～24 h，即得到壳聚糖空白微粒.

2 结果与讨论

2.1 微球的结构表征

2.1.1 红外光谱分析

壳聚糖与焦磷酸钠交联壳聚糖微粒的红外光谱如图1所示，壳聚糖上氨基和羟基的吸收峰出现在3 425 cm-1处，微粒产物对应的峰出现在3 359 cm-1处且变窄，这是因为一部分氨基被质子化后与阴离子静电吸附使吸收峰发生变化的结果.1 115 cm-1处和1 069 cm-1处是焦磷酸钠—P==O 官能团的吸收峰[11]，这表明交联微粒中含有焦磷酸钠,可证明微波辐射下以焦磷酸钠为交联剂成功地制备了壳聚糖微粒.

图1 壳聚糖及壳聚糖微球的红外光谱

2.1.2 壳聚糖微粒表面结构的表征

如图2所示，由图2(a)可以看到交联微粒，平均粒径在7～12 μm，符合肺靶向7～15 μm粒径范围要求，微粒表面有明显的层状结构.通过图2(b)可以看到微粒表面凹凸不平，比表面积较大，这有利于药物的负载；表面层状结构明显，结构紧密，这有利于药物的缓慢释放.由图2(c)、(d)可以看出微粒形较规则且分布均匀，黏连情况较少.

图2 空白微粒的扫描电镜图

2.2 单因素考察壳聚糖微粒制备工艺

以壳聚糖微粒形状、分布及平均粒径作为考察指标，分别对温度、交联时间、转速、正负离子摩尔比(交联剂的用量)4个因素进行单因素考察，选取壳聚糖微粒制备工艺的适宜条件.

2.2.1 温度对空白微粒平均粒径及分布的影响

使用微波辐射法制备壳聚糖空白微球，固定正负电荷摩尔比(30∶1)、转速(300 r/min)、滴定时间(15 min)、微波功率(1 360 W)，选取温度分别为20 ℃、40 ℃、60 ℃、80 ℃、100 ℃，考察温度对微粒平均粒径及微粒分布的影响，结果如图3所示.

图3 温度对壳聚糖微粒平均粒径的影响

反应温度在20～40 ℃时，对空白微球的粒径无明显的影响；但反应温度由40 ℃上升到80 ℃时，空白微粒的平均粒径随温度的升高而增大；当反应温度上升到100 ℃时，空白微粒的平均粒径有所减小.当反应温度超过90 ℃时，回流冷凝管里开始有液体回流，但温度上升到100 ℃时，反应溶液出现沸腾现象，并且有液体回流，反应溶液沸腾时的震荡，会将已形成的微粒打碎，从而使微粒的平均粒径减小.

如图4所示，(a)、(b)、(c)分别是反应温度为40 ℃、60 ℃、80 ℃所制备的壳聚糖微粒溶液在显微镜下放大400倍的图像.

图4 不同温度制得的微粒

由图4可以看出：反应温度40 ℃时，微粒形状较好，整体分布比较均匀，但微粒粒径较小；反应温度为60 ℃时，微粒形状为类球形，整体分布均匀，微粒平均粒径大小符合肺靶向(7～15 μm)要求；反应温度为80 ℃时，微粒大小均匀， 但微球大多粘连在一起，使整体分布不均匀，这也是反应温度80 ℃时，微粒平均粒径较大的原因之一.另外焦磷酸钠作为交联剂，它的水溶液在70 ℃以下比较稳定，当温度为80 ℃时，焦磷酸钠会水解成磷酸二氢钠，可能对反应造成影响.由上可知：反应温度为60 ℃时，制备出的壳聚糖微粒球型较好，分布均匀，粒径范围较窄，平均粒径在7～15 μm范围内的占62.8 %，比其他温度下所占比例都高.因此，微波辐射下反应的最佳温度为60 ℃.

2.2.2 交联时间对空白微粒平均粒径及分布的影响

使用微波辐射法制备壳聚糖空白微粒，固定正负电荷摩尔比(30∶1)、转速(300 r/min)、反应温度(60 ℃)、微波功率(1 360 W)，选取交联时间分别为5 min、10 min、15 min、20 min、25 min，考察时间对微粒平均粒径及微粒分布的影响，结果如图5所示.由图5可知：交联时间为5～20 min 时的粒径的大小相差不大.实验采用微波辐射法进行加热，其加热方式是通过磁场的变化使被加热的极性分子壳聚糖以及焦磷酸钠分子做轮摆运动，产生类似摩擦的作用，这种方式无需介质的传导，加热均匀，使物体本身成为加热源，从而提高了加热效率.前期实验中考察了交联时间1～5 min对微球质量的影响，结果表明交联时间少于5 min时，由于交联剂滴加速度过快，产生了过交联现象，微球大量聚集在一起，微粒平均粒径在25 μm左右，不符合预期要求.交联时间为5 min时，壳聚糖与交联剂焦磷酸钠已经完成离子交联反应，形成了壳聚糖微粒.滴定时间为10～20 min，空白微粒的平均粒径较5 min时变化不大，在这反应时间段粒径曲线比较平稳，说明在该时间段反应的时间对微球粒径的影响不大.交联时间为25 min时，微粒的平均粒径有下降的趋势，原因是由于反应过程中搅拌的时间较长,会将已形成的空白微粒打碎，造成微粒的平均粒径变小.

如图6所示，(a)、(b)、(c)分别是交联时间为5 min、10 min、15 min所制备的壳聚糖微粒溶液在显微镜下放大400倍的图像.滴定时间为5 min时，已经有微粒形成，微粒的形貌较好，整体分布较均匀.滴定时间为10 min及15 min时，微粒的形貌及分布状态与交联时间为5 min时差别不大.微波辐射法较水热法对反应的效率有很大的提高，反应时间由20 min(水热法)缩短到5 min(微波辐射法).由上可知：交联时间为5 min制备出的壳聚糖微粒形貌较好，分布均匀，粒径范围较窄，粒径在7～15 μm范围内的占54.42 %.因此，微波辐射下反应的最佳交联时间为5 min.

图5 时间对壳聚糖微粒平均粒径的影响

图6 不同交联时间制得的微粒

2.2.3 转速对空白微粒平均粒径及分布的影响

使用微波辐射法制备壳聚糖空白微球，固定正负电荷摩尔比(30∶1)、交联时间(5 min)、反应温度(60 ℃)、微波功率(1 360 W)，选取转数为300、400、500、600、700 r/min，考察转速对微粒平均粒径及微粒分布的影响，结果如图7所示.

图7 转数对壳聚糖微粒的平均粒径的影响

由图7可知：随着转速的增加，曲线有下降的趋势，表明随着转速的增加，壳聚糖微粒的平均粒径逐渐减小.转速在300 r/min时微粒的平均粒径最大，这是由于转速较小微球发生部分集聚现象致微粒平均粒径最大；当转数在400～600 r/min时曲线比较平稳，表明在这个范围内转数对微粒的平均粒径的影响不大；当转速为700 r/min时，微粒的平均粒径最小，这是由于转速过大会将壳聚糖微粒打碎，从而造成微粒平均粒径下降.

如图8所示，(a)、(b)、(c)分别为转速为300、400、500 r/min时所制备的壳聚糖微粒溶液在显微镜下放大400倍的图像.转速为300 r/min 和400 r/min时，微粒形状规整，整体分布均匀；转速超过500 r/min时，微粒数量明显减少，这是因为转速增加，有可能把刚形成的微粒打碎，致使微粒成粒量下降.由上可知：转速为400 r/min时,制备出的壳聚糖微粒形貌较好，分布均匀，粒径范围较窄，平均粒径在7～15 μm范围内的占64.32 %，因此，微波辐射下反应的最佳转速为400 r/min.

图8 不同转速制得的微粒

2.2.4 正负离子的摩尔比对空白微粒的平均粒径及球型分布的影响

使用微波辐射法制备壳聚糖空白微球，滴定时间为5 min，pH值为5.00，反应温度60 ℃，转速为400 r/min，微波功率为1 360 W.选取正负电荷摩尔比为20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1，考察正负离子的摩尔比对微粒平均粒径及球型分布的影响，结果如图9所示.由图9可知：正负电荷摩尔比在20∶1～40∶1的范围内时，壳聚糖微粒的平均粒径随正负电荷摩尔比的增加而减小；正负电荷摩尔比范围在40∶1～60∶1时，壳聚糖微粒的平均粒径随正负电荷摩尔比的增加而增加.当正负电荷摩尔比在20∶1时，由于加入的交联剂过量，发生过度交联，使形成的微粒聚集在一起，所以平均粒径较大.当正负电荷摩尔比为40∶1 时，由于加入交联剂的量下降，壳聚糖醋酸溶液的交联度也随着下降，壳聚糖分子链上成粒量下降，所以，微粒平均粒径也随着下降.当正负电荷摩尔比为50∶1和60∶1 时，加入的交联剂量进一步减少，交联度过低致使反应溶液中未交联的壳聚糖分子大量存在，这些壳聚糖会与溶液中的氢氧化钠溶液发生反应生成胶体，致使微粒平均粒径变大.

图9 正负电荷摩尔比对壳聚糖空白

如图10所示，(a)、(b)、(c)为正负离子摩尔比分别为30∶1、40∶1、50∶1时所制备的壳聚糖微粒溶液在显微镜下放大400倍的图像.正负离子摩尔比为30∶1时，微粒形状规则，整体分布均匀，没有聚集的情况出现；而当电荷摩尔比为40∶1 及50∶1 时，微粒形貌较差并且大多数聚集在一起，这是由于交联剂量不足，使一部分壳聚糖醋酸溶液未成微粒，在氢氧化钠作用下形成胶体.由上可知，正负离子摩尔比为30∶1时,制备出的壳聚糖微粒形貌较好，分布均匀，粒径范围较窄，粒径在7～15 μm范围内的占100 %.因此,微波辐射下反应的最佳正负离子摩尔比为30∶1.

图10 不同正负离子摩尔比制得的微粒

3 结 论

微波辐射下，以离子交联法制备壳聚糖微粒的方法简单可行，这种制备方法具有交联时间短、微粒分布均匀的特点.焦磷酸钠作为交联剂避免了传统交联剂，如戊二醛，对人体的损害.由实验结果得出制备壳聚糖微球的最佳工艺条件：反应温度为60 ℃，交联时间为5 min，转速为400 r/min，正负电荷摩尔比为30∶1.通过该方法获得的壳聚糖微粒作为制备治疗肺靶向药物载体(粒径范围7～15μm)，环保无毒，制备工艺简便，成本低廉.

[1] UPADHYAYA L,SINGH J,AGARWALC V,et al.Biomedical Applications of Carboxymethyl Chitosans[J].Carbohydrate Polymers,2013,91 (1):452-466.

[2] DUARTE A R C,MANO J F,REIS R L.Novel 3D Scaffolds of Chitosan-PLLA Blends for Tissue Engineering Applications:Preparation and Characterization[J].The Journal of Supercritical Fluids,2010,54(3):282-289.

[3] CSABA N,KÖPING-HÖGGÅRD M,ALONSO M J.Ionically Crosslinked Chitosan/Tripolyphosphate Nanoparticles for Oligonucleotide and Plasmid DNA Delivery[J].International Journal of Pharmaceutics,2009,382 (1/2):205-214.

[4] HOMAYONI H,RAVANDI S A H,VALIZADEH M.Electrospinning of Chitosan Nanofibers:Processing Optimization[J].Carbohydrate Polymers,2009,77(3):656-661.

[5] LAMEIRO M H,LOPES A,MARTINS L O,et al.Incorporation of a Model Protein into Chitosan-bile Salt Microparticles[J].International Journal of Pharmaceutics,2006,312 (1/2):119-130.

[6] GANDHI R M,KOUSALYA G N,VISWANATHAN N,et al.Sorption Behaviour of Copper on Chemically Modified Chitosan Beads from Aqueous Solution[J].Carbohydrate Polymers,2011,83(3):1082-1087.

[7] BEPPU M M,VIEIRA R S,AIMOLI C G,et al.Crosslinking of Chitosan Membranes Using Glutaraldehyde:Effect on Ion Permeability and Water Absorption [J].Journal of Membrane Science,2007,301 (1/2):126-130.

[8] SINHA V R,SINGLA A K,WADHAWAN,et al.Chitosan Microspheres as a Potential Carrier for Drugs[J].International Journal of Pharmaceutics,2004,274 (1/2):1-33.

[9] 李若慧，程艳玲.以壳聚糖为载体的药物新剂型[J].北京联合大学学报(自然科学版)，2008,22 (3):30-34.

[10]SOSNIK A,GOTELLI G,ABRAHAM G A.Microwave-assisted Polymer Synthesis (MAPS) as a Tool in Biomaterials Science:How New and How Powerful[J].Progress in Polymer Science,2011,36 (8):1050-1078.

[11]IKEDA S,KUMAGAI H,SAKIYAMA T,et al.Method for Analyzing pH-sensitive Swelling of Amphoteric Hydrogels-Application to a Polyelectrolyte Complex Gel Prepared from Xanthan and Chitosan[J].Bioscience,Biotechnology and Biochemisty,1995,59 (8):1422-1427.

Prepared of Chitosan Microspheres by Ionic Crosslinking Method under Microwave Irradiation

SONG Lin1，2， NIAN Zhong-feng1， YANG Di1， JIANG Fu-yu1， LIU Xue-gui1

(1.Shenyang University of Chemical Technology, Shenyang 110142， China;2.Northeast Pharmaceutical Group, Shenyang 110026, China)

Chitosan microspheres were prepared via an ion cross-linking technique under microwave irradiation using chitosan as a drug carrier and sodium pyrophosphate as a cross linker reagent.The particle size,morphology and dispersity of microspheres were used to evaluate the influence of the prepared processes.The morphology and structure of the microspheres were characterized by scanning electron microscopy，light microscope and infrared spectrum.The optical conditions to prepare the chitosan microsphere were:60 ℃,cross linking time of 5 min,mole ratio of cation and anion was 30∶1,and a stirring speed 400 r/min.

chitosan microsphere; sodium pyrophosphate; microwave irradiation; ionic cross-linking

2014-11-28

宋林(1988-),男(满族),辽宁东港人,硕士研究生在读,主要从事药学的研究.

刘学贵(1972-),男,山东安丘人,副教授,博士,主要从事无机矿物资源的开发及应用研究.

2095-2198(2017)01-0029-07

10.3969/j.issn.2095-2198.2017.01.006

O636.1; R94

A