甲醇溶液中酒石酸辅助尿素包合法富集α-亚麻酸

程 婷，杨国龙，毕艳兰

（河南工业大学 粮油食品学院，河南 郑州 450001）

甲醇溶液中酒石酸辅助尿素包合法富集α-亚麻酸

程 婷，杨国龙*，毕艳兰

（河南工业大学 粮油食品学院，河南 郑州 450001）

以亚麻籽油为原料，采用酒石酸辅助尿素包合法富集其中的α-亚麻酸。研究了尿素/混合脂肪酸（mixed fatty acids，MFAs）、甲醇/MFAs、结晶温度和结晶时间对酒石酸辅助尿素包合法富集α-亚麻酸的影响；比较了甲醇体系中酒石酸辅助尿素包合法与传统尿素包合法富集α-亚麻酸产品中α-亚麻酸的纯度与回收率。研究发现，包合过程中的被包合顺序依次为：棕榈酸 ≈ 硬脂酸 > 油酸 >> 亚油酸 > α-亚麻酸；酒石酸/尿素为 1∶3(n/n)、尿素/MFAs为 2.5∶1（m/m）、甲醇/MFAs为 10∶1（V/m），结晶温度-8 ℃、结晶 8 h时，富集产品中 α-亚麻酸含量为 78.6%，α-亚麻酸的回收率为60.9%。

酒石酸；尿素包合；富集；α-亚麻酸；甲醇

0 前言

α-亚麻酸是人体必需脂肪酸，对人类营养和疾病预防具有重要意义，在食品、药品、保健品、化妆品行业有广泛的应用[1]。关于α-亚麻酸富集方法的研究有很多[2-11]，尿素包合法以尿素独特的四方晶型，在与脂肪酸共溶于溶剂重新结晶时，可以包裹直链的脂肪酸形成六方晶体，而不饱和酸由于其双键使分子的体积增大，因此不易被尿素包裹，双键越多越不易包合，从而可以对饱和酸和不饱和酸进行分离[4]。尿素包合法具有设备简单、操作方便、成本较低等特点，因此被广泛应用于α-亚麻酸等多不饱和酸的富集[2-11]；尿素包合过程中的因素，如尿素用量、溶剂种类和用量、结晶温度、结晶时间都会影响富集的效果。尿素包合法纯化亚麻籽油中α-亚麻酸的研究很多，但存在收率不高的问题。

酒石酸是一种含有多个羟基的短碳链羧酸，易与尿素以氢键联结[12-13]，也常用作缓凝剂[14]。已有研究发现酒石酸可以在尿素包合的过程中与尿素结合，辅助尿素包合脂肪酸，影响尿素包合物的结构，从而改善包合的效果[15]。作者以亚麻籽油为原料，研究了酒石酸辅助尿素包合法富集α-亚麻酸的工艺，在提高α-亚麻酸纯度的同时，提高其回收率；并且研究了富集过程中各种脂肪酸在包内和包外的分配规律，为α-亚麻酸的实际生产提供理论指导。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

冷榨亚麻籽油：呼和浩特市蒙谷香生物科技有限公司；酒石酸（>99.5%）：阿拉丁（上海）试剂有限公司；尿素、甲醇：分析纯，天津科密欧试剂厂。脂肪酸组成：棕榈酸（C16:0）6.0%、硬脂酸（C18:0）4.5%、油酸（C18:1）21.1%、亚油酸（C18:2）13.7%、α-亚麻酸（C18:3）54.7%。

1.2 主要仪器

90-1型恒温磁力搅拌器：上海沪西分析仪器有限公司；Agilent 6890N气相色谱仪：美国Agilent公司；F25-ME型高低温循环器：德国Julabo公司；RV10型旋转蒸发仪：德国IKA集团。

1.3 方法

1.3.1 混合脂肪酸的制备

称取200 g亚麻籽油加入到400 mL 0.2 g/mL NaOH-95%乙醇溶液中，于80℃水浴中皂化回流4 h，然后加入100 mL石油醚继续回流30 min。离心分离除去石油醚层，下层皂用6 mol/L盐酸溶液酸解至pH为2左右。经水洗，无水硫酸钠除水，减压旋转蒸发除去溶剂后得混合脂肪酸（mixed fatty acids,MFAs）[6]。

1.3.2 α-亚麻酸的纯化

(1)尿素包合法参照李桂华等[2]的方法进行。

(2)酒石酸辅助尿素包合法：将酒石酸与尿素按一定比例溶于甲醇溶液中，待两者完全溶解后将20 g MFAs加入其中，于60℃下加热回流2 h。而后将混合液静置冷至室温，然后于更低温度下养晶。一段时间后取出迅速减压抽滤，得到固相（酒石酸-尿素-脂肪酸）和液相（以α-亚麻酸为主的不饱和脂肪酸）。

向液相中加入适量饱和食盐水和石油醚于分液漏斗中分层，弃去下层水相，取上层有机相用去离子水洗至中性，经无水硫酸钠脱水后，减压旋转蒸发除出有机溶剂，即得到富含α-亚麻酸的产品。

取固相溶于热饱和食盐水中，待完全溶解后，转移至分液漏斗中，并加适量石油醚，静置分层，除去下层水相，反复洗涤，至水洗液呈中性。向有机相加入无水硫酸钠脱水，然后减压旋转蒸发除去有机溶剂，即得未包合的脂肪酸产品。

式中：C为产品中某脂肪酸的含量，%；C0为原料中某脂肪酸的含量，%；m为产品质量，g；m0为原料质量，g。

1.3.3 脂肪酸组成分析

脂肪酸经BF3甲酯化后，用气相色谱分析样品的脂肪酸组成[12]。色谱柱：BPX-70（30 m×250 μm×0.25 μm，澳大利亚SGE公司）；进样口温度：210℃；柱温：190 ℃；载气：N2；流速：1.2 mL/min；检测器温度，300℃。

2 结果与分析

2.1 尿素/MFAs对酒石酸辅助尿素包合法富集α-亚麻酸的影响

以甲醇为溶剂，酒石酸辅助尿素包合法富集α-亚麻酸过程中，包合体系液相中脂肪酸的组成及回收率如图1-A、图1-B所示，随着尿素/MFAs（U/MFAs，m/m，下同）从1∶1 增至 3∶1，液相中饱和脂肪酸（硬脂酸、棕榈酸）含量和回收率均逐步减小，到U/MFAs为3∶1时饱和脂肪酸的含量和回收率趋近于 0。U/MFAs由 1∶1 增加到 3∶1，油酸的含量缓慢下降，由18.5%降到2.6%，但油酸回收率却快速下降，由73%降到5.3%。亚油酸的含量随U/MFAs增加变化不明显，在20%左右，亚油酸回收率明显降低，由96.9%降低到54.1%。当U/MFAs由1∶1增加到3∶1时，α-亚麻酸的含量呈逐渐上升趋势，从60.9%提高到78.5%，α-亚麻酸回收率逐渐下降，从92.9%下降至61.4%。

林非凡等[7]采用尿素包合法提高α-亚麻酸的含量，在 MFAs∶尿素∶无水乙醇=1∶3∶7(m/m/V)条件下，包合温度和时间分别为-20℃、30 h时，得到α-亚麻酸含量为93.3%的产物，但没有给出α-亚麻酸的回收率。韩丹丹[9]研究得到最佳工艺为结晶温度-20 ℃，MFAs:尿素:乙醇为 1∶1.5∶9(m/m/V)，结晶时间12 h，得到α-亚麻酸回收率为5.6%，α-亚麻酸含量从52.8%提高到76.3%。

固相包合物中脂肪酸组成及回收率如图1-C、图1-D所示。当 U/MFAs由1∶1增加到3∶1的过程中，硬脂酸和棕榈酸的含量缓慢降低，分别由16.1%、26.3%降低到6.6%、10.3%；硬脂酸和棕榈酸的回收率逐渐上升，在U/MFAs为2∶1以后基本趋于平稳，分别达到81.9%和97%左右。油酸的含量先稍有增加（38.7%～42.2%）又下降（42.2%～34.8%），油酸的回收率也呈现先增加（26.5%～82.5%）后下降（82.5%～48%）的趋势；亚油酸的含量由4.2%增加到10.9%，亚油酸回收率由4.4%增加到 44.9%。α-亚麻酸的含量由 13%增加到35.9%，α-亚麻酸回收率由3.4%增加到36.8%。随着尿素用量的增加，棕榈酸、硬脂酸和油酸的回收率会达到平衡，而亚油酸和α-亚麻酸的回收率则一直在增加（图 1-D），这说明当尿素用量增加到一定值后，再增加尿素用量对饱和酸来说没有影响，只会使更多的不饱和脂肪酸进入包合物，从而使液相脂肪中不饱和脂肪酸的回收率下降（图 1-C），但其含量并没有显著的变化（图 1-D）。

U/MFAs在 1∶1 至 3∶1 内，相同 U/MFAs时，固相包合物中各脂肪酸回收率顺序为棕榈酸≈硬脂酸 >油酸 >>亚油酸 >α-亚麻酸（图 1-D），这说明在包合过程中棕榈酸和硬脂酸最容易被包合，其次是油酸，亚油酸和α-亚麻酸不容易被包合，比较而言α-亚麻酸最难被包合。

2.2 甲醇/MFAs对酒石酸辅助尿素包合法富集α-亚麻酸的影响（图2）

液相非包合物中脂肪酸组成主要为油酸、亚油酸、α-亚麻酸（图2-A），硬脂酸和棕榈酸的含量不超过1%。液相非包合物中亚油酸和α-亚麻酸含量分别为70%和20%左右，随着甲醇/MFAs（V/m，下同）从 9∶1增至 13∶1，其含量略有降低；油酸的含量随甲醇/MFAs的增加而略有增加。α-亚麻酸和亚油酸的回收率随甲醇/MFAs的增加没有明显变化，均在80%左右，但甲醇/MFAs由 9∶1增加到13∶1时，油酸的回收率由25%左右增加到约37%。这主要是由于随着甲醇/MFAs的增加，溶剂的量不断增大，尿素、脂肪酸、酒石酸在溶剂中分散得更加充分，使得尿素、脂肪酸的碰撞几率加大，包合长碳链饱和酸的选择性增加，油酸、亚油酸、α-亚麻酸在液相非包合物中被富集。

图1 尿素/MFAs对酒石酸辅助尿素包合法富集α-亚麻酸的影响Fig.1 The effects of urea to MFAs ratio on αlinolenic acid(α-LA)

图2 甲醇/MFAs对酒石酸辅助尿素包合法富集α-亚麻酸的影响Fig.2 The effects of methanol to MFAs ratio on αlinolenic acid(α-LA)

2.3 结晶温度对酒石酸辅助尿素包合法富集α-亚麻酸的影响

在酒石酸辅助尿素包合法富集α-亚麻酸时，温度对液相非包合物中脂肪酸组成和各脂肪酸回收率的影响如图3所示。随着结晶温度的升高，棕榈酸、硬脂酸和油酸的含量略有增加，而亚油酸和α-亚麻酸的含量略有降低（图3-A）；棕榈酸和硬脂酸的回收率缓慢增加，油酸的回收率快速增加，亚油酸和α-亚麻酸的回收率先略有增加而后略有降低。当结晶温度为-16℃时，液相非包合物中α-亚麻酸的含量达极大值72.2%，亚油酸的含量为17.4%，油酸的含量为最小值8.7%，亚油酸和油酸的回收率都为极小值（分别为82.1%和26.6%）；硬脂酸和棕榈酸的含量和回收率都小于1%。在结晶温度为16℃时，液相非包合中硬脂酸和棕榈酸的回收率仍较高，分别高达8.4%和29.5%。

图3 结晶温度对酒石酸辅助尿素包合法富集α-亚麻酸的影响Fig.3 The effects of crystallization temperature on α-linolenic acid(α-LA)

2.4 结晶时间对酒石酸辅助尿素包合法富集α-亚麻酸的影响

尿素包合反应是一个动态的平衡过程，在酒石酸的辅助作用下，结晶时间超过8 h后，包合反应的动态平衡已基本形成，液相非包合物中各脂肪酸的含量基本维持不变（图4-A）；棕榈酸和硬脂酸的含量在1%以下，油酸、亚油酸和α-亚麻酸的含量分别为10%、17%和70%左右。棕榈酸、硬脂酸和油酸的回收率也基本维持不变，而亚油酸和α-亚麻酸的回收率略有降低（图4-B）。棕榈酸和硬脂酸回收率分别在8%和3%以下，油酸的回收率为30%左右，亚油酸的回收率为75%～80%，α-亚麻酸的回收率为80%～82%。传统尿素包合法富集α-亚麻酸时，包合时间都在12 h以上[2,7,9]，而本研究中包合时间为8 h，比传统尿素包合法的包合时间大大缩短，提高了效率。

图4 结晶时间对酒石酸辅助尿素包合法富集α-亚麻酸的影响Fig.4 The effects of crystallization time on αlinolenic acid(α-LA)

2.5 酒石酸辅助尿素包合法与传统尿素包合法富集α-亚麻酸的比较

由图 5可知，采用传统尿素包合法富集α-亚麻酸时，产品中的α-亚麻酸的含量为80.2%，回收收率为41.4%。酒石酸辅助尿素包合法纯化得到的α-亚麻酸产品中，α-亚麻酸的含量为78.6%，回收率为60.9%；与传统尿素包合法相比，α-亚麻酸的含量略有降低，但回收率大大提高。

如图6所示，传统尿素包合法形成的包合物晶体平均长度为1～2 mm，酒石酸-尿素-脂肪酸包合物晶体平均长度达0.7 cm，最长的可达1.5 cm，晶体尺寸远大于尿素-脂肪酸晶体。这与陈素琴等[15]在研究酒石酸辅助尿素包合法纯化红花籽油时的结果相似。大晶体聚集时形成的空隙大于小晶体间的空隙，过滤时，包合物晶体与未包合物液体更容易分离，使得酒石酸-尿素-脂肪酸晶体吸附目标不饱和脂肪酸的量大大降低，故可以在得到高纯度α-亚麻酸的同时，大大提高其回收率。

图5 传统尿素包合法与酒石酸辅助尿素包合法对α-亚麻酸富集效果的对比Fig.5 Comparison of traditional urea fractionation and tartaric acid-assisted urea fractionation on enrichment of α-LA

图6 尿素-脂肪酸晶体与酒石酸-尿素-脂肪酸晶体Fig.6 UIC crystal and tartaric acid-assisted UIC crystal

3 结论

酒石酸辅助尿素包合法富集脂肪酸过程中，各脂肪酸包合的优先顺序依次为：棕榈酸 ≈ 硬脂酸>油酸 >>亚油酸 >α-亚麻酸。在酒石酸/尿素比为 1∶3（n/n），尿素/脂肪酸比为 2.5∶1（m/m），甲醇/脂肪酸比为 10∶1（V/m），结晶温度-8 ℃，结晶 8 h时，富集产品中α-亚麻酸含量为78.6%，α-亚麻酸的回收率为60.9%。采用此法能够缩短尿素包合的时间，并能提高α-亚麻酸的回收率。

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ENRICHMENT OF α-LINONEIC ACID BY TATARIC ACID-ASSISTED UREA FRACTIONATION IN METHANOL

CHENG Ting，YANG Guolong，BI Yanlan
（School of Food Science and Technology，Henan University of Technology，Zhengzhou 450001，China）

Tartaric acid is a short carbon chain carboxylic acid with multi-hydroxyl group，which is easy to link with urea with hydrogen bond.It has been found that tartaric acid can assist the inclusion of fatty acids with urea in inclusion process，so as to improve the effect of inclusion.The present study was to investigate the enrichment of α-linolenic acid （α-LA）from linseed oil by tartaric acid-assisted urea fractionation.The effects of ratio of urea and mixed fatty acids （MFAs），ratio of methanol and FAs，crystallization temperature and time on the enrichment of α-LA by the tartaric acid-assisted urea fractionation were studied.The purity and yield of α-LA in the enriched products obtained by the tartaric acid-assisted urea fractionation and traditional urea fractionation in methanol were compared.The results showed that the order of the fatty acids involved in the inclusion complex was palmitic acid≈ stearic acid>oleic acid>>linoleic acid>α-LA.Under the optimum conditions of tartaric acid-to-urea ratio of 1∶3 （n/n），urea-to-MFAs ratio of 2.5∶1 （m/m），methanol-to-MFAs ratio of 10∶1（V/m），crystallization temperature of-8 ℃ and crystallization time of 8 h，the purity and yield of α-LA in the enriched product were 78.6%and 60.9%，respectively.

tartaric acid；urea-fractionation；enrichment；α-linolenic acid；methanol

TS225.1

B

1673-2383(2017)03-0012-06

http://kns.cnki.net/kcms/detail/41.1378.N.20170621.1050.006.html

网络出版时间：2017-6-21 10:50:22

2016-11-21

河南省高等学校青年骨干教师资助计划项目（2011GGJS-079）

程婷（1990—），女，河南新乡人，硕士研究生，研究方向为脂质分离技术。

*通信作者