酶催化棕榈硬脂分子内重排制备sn-2位富含棕榈酸甘油三酯的研究

蒋志磊，梁少华，倪常程

（河南工业大学 粮油食品学院，河南 郑州 450001）

酶催化棕榈硬脂分子内重排制备sn-2位富含棕榈酸甘油三酯的研究

蒋志磊，梁少华*，倪常程

（河南工业大学 粮油食品学院，河南 郑州 450001）

以棕榈硬脂为原料，在脂肪酶Lipozyme TL IM催化作用下，通过分子内重排的形式制备sn-2位富含棕榈酸的甘油三酯，用于后期制备人乳脂替代品的原料。以酯交换产物中sn-2位棕榈酸含量为响应值，考察各反应因素对工艺条件的影响。结果表明：当反应温度为79℃，反应时间为13 h，加酶量为6%（以总底物质量计）时，sn-2位棕榈酸含量可达58.01%，可满足制备人乳脂替代品的原料要求。

棕榈硬脂；脂肪酶；分子内重排；sn-2位富含棕榈酸的甘油三酯

0 引言

人乳是新生婴幼儿最佳的营养来源，为其成长提供充足的能量和必需脂肪酸等营养物质[1]。人乳中含有3%～5%的脂质，其中98%以上都是以甘油三酯的形式存在[2]。人乳脂具有特殊的甘油三酯结构，其中最主要成分是1，3-二油酸-2-棕榈酸甘油三酯（OPO），即棕榈酸主要分布在甘油三酯的sn-2位，不饱和脂肪酸如油酸、亚油酸、亚麻酸等则主要分布在sn-1，3位[3]。大量研究表明，人乳脂这种特殊的甘油三酯结构，能够促进婴幼儿对钙质和能量的吸收，显著地降低婴幼儿腹泻、便秘和肠梗塞等症状[4-5]。然而由于现代人为因素、社会问题、环境污染等多方面外界因素的影响，母乳供给不足、母乳营养缺失以及母乳喂养条件缺乏等问题已经成为不争的事实，婴幼儿配方奶粉则成为婴幼儿可供选择的母乳替代品之一[6]。传统婴幼儿配方奶粉主要是通过添加多种植物油与牛乳调和而成，虽然其脂肪酸含量与人乳脂相接近，但是其脂肪结构与人乳脂差异较大[7]。研究表明，这种通过物理调和而成的脂肪在婴幼儿体内不仅很难被消化吸收，而且会因与钙质结合导致钙质的流失[8]。

棕榈硬脂是棕榈油分提之后的产物，应用较为广泛，特别是在化工行业中作为生物柴油、肥皂、润滑剂等的生产原料[9]。棕榈硬脂中含有丰富的棕榈酸，但其棕榈酸主要集中在sn-1,3位。因此，对棕榈硬脂的sn-2位棕榈酸进行富集是制备人乳脂替代品的必要条件。作者以脂肪酶Lipozyme TL IM为催化剂，通过分子内重排反应的形式对棕榈硬脂中sn-2位棕榈酸进行富集，用于后期制备人乳脂替代品的原料。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

52℃棕榈硬脂：天津嘉里粮油工业有限公司；脂肪酶 Lipozyme TL IM（Thermomyces lanuginosus）：诺维信，丹麦；猪胰脂酶：自制。

正己烷（色谱纯）；硅胶GF254(化学纯)；乙醚、胆酸钠、无水硫酸钠、甲醇、钠、甲酸、羧甲基纤维素钠、三羟甲基氨基甲烷、2′,7′-二氯荧光素等均为分析纯。

1.2 主要仪器和设备

Agilent7890A型气相色谱仪：美国Agilent Technologies公司；80-2台式电动离心机：金坛市华锋仪器有限公司；HH-2J型数显搅拌水浴锅：上海维诚仪器有限公司；DF-101K集热式恒温磁力搅拌器：郑州长城科工贸有限公司。

1.3 方法

1.3.1 脂肪酶催化棕榈硬脂分子内重排制备sn-2位富含棕榈酸甘油三酯

在50 mL的圆底烧瓶中加入一定质量的棕榈硬脂，在磁力搅拌水浴中预热至反应温度，待温度稳定后，称取一定质量（以总底物质量计）的脂肪酶Lipozyme TL IM，以及一定质量（以酶的质量计）的去离子水至烧瓶中并记录时间。反应至预设时间后停止，除去酶并干燥脱水后对产物进行分析。

1.3.2 分析方法

1.3.2.1 总脂肪酸组成分析

通过薄层层析进行甘三酯的分离。称取一定量的待测样品过滤去除脂肪酶后，在离硅胶板（10 cm×20 cm）底端约1.5 cm处点样，置于层析槽中进行薄层层析。层析液为正己烷∶乙醚∶甲酸=70∶30∶1(V/V/V)。经薄层层析后确定甘三酯，刮取甘三酯条带于长试管中，根据GB/T 17377—2008甲酯化方法进行甲酯化处理，取上层有机相，经气相色谱进行检测，测定试样中总脂肪酸组成及含量。

气相色谱条件：BPX-70毛细管脂肪酸分析柱，30.0 m×250 μm×0.25 μm，进样口温度 230 ℃，柱温190℃，氢离子火焰检测器（FID），检测器温度300℃，氮气流速1.0 mL/min，氢气流速40 mL/min，空气流速 450 mL/min。

1.3.2.2 sn-2位脂肪酸组成分析

通过薄层层析进行甘三酯的分离（同上）。刮取甘三酯于试管中，依次加入25 mg胰脂酶及2 mL缓冲溶液，摇匀。再加入0.4 mL胆酸钠溶液（2 g/L）及0.2 mL氯化钙溶液，摇匀，置于40°C恒温水浴中保温3 min，后加入1 mL盐酸溶液及2 mL乙醚，摇匀，置于离心机中离心2 min，转速为2 500 r/min。取上清液，经薄层层析后显色确定甘一酯，甘一酯甲酯化后，经气相色谱分析sn-2位脂肪酸组成[10]。

1.4 试验方案设计

棕榈硬脂在脂肪酶Lipozyme TL IM催化作用下进行分子内重排反应，制备sn-2位富含棕榈酸甘油三酯。影响分子内重排反应的因素包括反应温度、加酶量、加水量和反应时间。以sn-2位棕榈酸含量为评价指标，根据单因素试验结果，利用Box-Benhnken的中心组合试验设计原理进行三因素三水平的响应面优化试验设计，表1为因素水平编码。

表1 响应面试验因素与水平编码Table 1 Factors and levels of response surface analysis

2 结果与分析

2.1 棕榈硬脂脂肪酸组成分析

在已知全样油脂及该油脂sn-2位脂肪酸组成及含量的前提下，则可根据sn-1，3-随机-2-随机分布学说计算出sn-1,3位脂肪酸含量[11]，结果如表2所示。

表2 棕榈硬脂的立体专一分布Table 2 Stereospecific distribution of fatty acids in palm stearin %

由表2可知，棕榈硬脂中主要以饱和脂肪酸棕榈酸为主，含量约为58.76%，主要集中在sn-1,3位，其次还有少量的硬脂酸，含量约为6.19%；不饱和脂肪酸主要以油酸为主，含量约为27.12%，主要分布在sn-2位，另外还有少量的亚油酸、亚麻酸等。棕榈硬脂中饱和脂肪酸含量大约是不饱和脂肪酸两倍之多，因此，与其他植物油脂相比，棕榈硬脂具有更高的氧化稳定性，这与吴苏喜等[12]的研究结果一致。

2.2 脂肪酶Lipozyme TL IM催化棕榈硬脂分子内重排单因素试验

2.2.1 反应温度对产物中sn-2位棕榈酸含量的影响

在50 mL的圆底烧瓶中加入一定量的棕榈硬脂，在加酶量为4%，加水量为10%，反应时间为8 h的条件下，分别控制反应温度为 55、65、75、85、95℃，考察其对产物中sn-2位棕榈酸含量的影响，结果如图1所示。

图1 反应温度对产物中sn-2位棕榈酸含量的影响Fig.1 The effect of reaction temperature on the palm acid content on the sn-2 position of the products

由图1可知，在55～75℃时，sn-2位棕榈酸含量随着温度的升高而不断增加，这说明在一定温度范围内，脂肪酶的活性较低，75℃之前脂肪酶的活性未达到最佳。75℃之后，sn-2位棕榈酸含量增长趋于平缓，没有显著提高。说明随着反应的进行，在反应初始阶段，由于脂肪酶活力和底物黏度不断改善，产物中sn-2位棕榈酸含量逐渐增加。脂肪酶催化目标产物合成效应与脂肪酶变异趋于平衡，所以目标产物含量不再增加。因此，选择75℃较为合适。

2.2.2 加酶量对产物中sn-2位棕榈酸含量的影响

在50 mL的圆底烧瓶中加入一定量的棕榈硬脂，在反应温度为75℃，加水量为10%，反应时间为8 h条件下，分别控制加酶量为2%、4%、5%、6%、8%、9%、10%、11%，考察其对产物中sn-2位棕榈酸含量的影响，结果如图2所示。

图2 加酶量对产物中sn-2位棕榈酸含量的影响Fig.2 The effect of enzyme load on the palm acid content on the sn-2 position of the products

由图2可知，当加酶量为棕榈硬脂质量的2%时，sn-2位棕榈酸含量为44.97%，酯交换程度较低。当加酶量从2%增加到6%的过程中，sn-2位棕榈酸含量急剧增加。加酶量高于6%后，sn-2位棕榈酸含量趋于平衡，这是因为脂肪酶的添加量只能相对缩短反应达到平衡所需的时间，而不会加剧提高sn-2位棕榈酸的含量，当酶与底物达到饱和后，加酶量的增加对酯交换程度影响不大。因此，选择最佳加酶量为底物质量的6%较为适宜。

2.2.3 加水量对产物中sn-2位棕榈酸含量的影响

在50 mL的圆底烧瓶中加入一定量的棕榈硬脂，在反应温度为75℃、加酶量为6%，反应时间为8 h条件下，分别控制加水量为0%、5%、10%、15%和20%。产物中sn-2位棕榈酸含量随加水量的变化如图3所示。

图3 水分含量对产物中sn-2位棕榈酸含量的影响Fig.3 The effect of water content on the palm acid content on the sn-2 position of the products

由图3可知，随着加水量的逐渐增加，产物中sn-2位棕榈酸含量整体呈现下降趋势，但幅度较小。与空白对照试验组相比较，sn-2位棕榈酸含量下降趋势微弱，仅在3%左右。过多的水分不仅会导致脂肪酶活性下降，同时也会增加试验操作的复杂性。因此，加水量的多少对sn-2位棕榈酸含量影响不显著，故在响应面优化试验中选择不加水。

2.2.4 反应时间对产物中sn-2位棕榈酸含量的影响

在50 mL的圆底烧瓶中加入一定量的棕榈硬脂，在反应温度为75℃，加酶量为6%，无额外水分添加的条件下，分别反应 2、4、6、8、10、12、14、16、18 h，产物中sn-2位棕榈酸含量随反应时间的变化如图4所示。

由图4可知，脂肪酶Lipozyme TL IM催化棕榈硬脂分子内重排反应时间较长，反应开始12 h后产物中sn-2位棕榈酸含量增长速率才开始降低，延长反应时间至18 h，目标产物中sn-2位棕榈酸含量增长幅度很小。反应进行到12 h，sn-2位棕榈酸含量达到58.06%，比原料油脂增加了20.05%。出现该种结果的原因主要是反应初始阶段底物较充足，随着反应的不断进行底物浓度呈现下降趋势。因此，考虑到反应效率和经济性，选择最佳反应时间为12 h。

图4 反应时间对产物中sn-2位棕榈酸含量的影响Fig.4 Effect of reaction time on on the palm acid content on the sn-2 position of the products

2.3 脂肪酶Lipozyme TL IM催化棕榈硬脂分子内重排反应工艺优化

2.3.1 中心组合试验设计与结果

根据中心组合试验设计原理，选取反应温度（A）、反应时间（B）及加酶量（C）为影响因素，以产物中sn-2位棕榈酸含量为响应值，响应面分析设计方案及试验结果见表3。

表3 中心组合试验设计与结果Table 3 Design and result of Box-Behnken experiment

2.3.2 脂肪酶催化棕榈硬脂分子内重排反应对sn-2位棕榈酸含量影响的方差分析

根据表3数据，利用Design-Expert8.0.5.0软件对脂肪酶Lipozyme TL IM催化反应产物中sn-2位棕榈酸含量的17组试验结果进行多次拟合回归分析，得到sn-2位棕榈酸含量的多项回归方程，方程的回归方差分析见表4。

表4 方差分析Table 4 Variance analysis

sn-2位棕榈酸含量/%=58.08+1.97×A+1.75×B+0.60×C-0.82×A×B+0.90×A ×C-0.61×B×C-0.22×A2-1.56×B2-0.91×C2。

由表4可知，模型高度显著（P<0.000 1），失拟项不显著（P=0.462 3>0.05），由此可以推断出该模型的预测值与实际值较为相近，试验结果可靠。3个因素对结果的影响均高度显著（P<0.01）。交互项中反应温度与反应时间（AB）、反应时间与加酶量（BC）对结果影响均显著（P<0.05）。二次项对结果的影响均显著（P<0.05）。根据方差分析结果得出回归方程的复相关系数为0.979 7，校正相关系数为0.929 7，说明该模型能解释响应值变化的92.97%，拟合程度较好，能较好地反映试验结果。

2.3.3 反应因素间交互作用对sn-2位棕榈酸含量的影响

根据脂肪酶Lipozyme TL IM催化棕榈硬脂分子内重排反应产物中sn-2位棕榈酸含量回归方程作出各因素间交互作用响应曲面与等高线分析图（图 5—图 7）。

图5表示在加酶量6%的条件下，反应温度与反应时间两因素及其交互作用对sn-2位棕榈酸含量的影响。当温度较低时，随着反应时间的延长，sn-2位棕榈酸含量不断增加；当反应温度处于较高水平时，随着反应时间的延长，sn-2位棕榈酸含量呈微弱下降趋势；当反应时间在10～12 h之间时，sn-2位棕榈酸含量随着反应温度的升高而不断增加；但是当反应时间超过12 h以后，反应温度对产物中sn-2位棕榈酸含量影响不显著。

图6表示在反应时间12 h条件下，加酶量与反应温度两因素及其交互作用对sn-2位棕榈酸含量的影响。反应温度一定时，随着加酶量的增加，sn-2位棕榈酸含量不断增加。当加酶量＞6%时，sn-2位棕榈酸含量增长缓慢。这是因为当反应时间一定时，脂肪酶Lipozyme TL IM受到了体系内底物浓度的限制，致使增长减缓。因此最优反应温度在75℃左右。

图7表示在反应温度75℃，加酶量与反应时间两因素及其交互作用对sn-2位棕榈酸含量的影响。最优加酶量为6%～6.5%，最优反应时间在12～13 h之间。当反应时间一定时，增加反应体系中脂肪酶Lipozyme TL IM的量，反应产物中sn-2位棕榈酸含量呈现先增高后趋于平缓的趋势。这是因为在初始反应阶段，加酶量相对较少，增大加酶量，即增加了脂肪酶Lipozyme TL IM的活性位点，反应速度加快。但由于底物浓度的限制，脂肪酶Lipozyme TL IM量增加至一定值时，剩余结合的底物分子较少，碰撞概率降低，因此反应趋势减缓。

图5 反应温度与反应时间交互作用对sn-2位棕榈酸含量影响的响应曲面Fig.5 Response surfaces plot of the effect of interaction of reaction temperature and reaction time on the palm acid content on the sn-2 position of the products

2.4 脂肪酶催化棕榈硬脂分子内重排反应工艺条件确定与验证

由响应面软件得出理论最优因素的水平分别为反应温度78.68℃，加酶量6.21%，反应时间为12.85 h，在此条件下脂肪酶Lipozyme TL IM催化棕榈硬脂分子内重排反应所得产物中sn-2位棕榈酸含量的理论预测含量为58.88%。

由于试验操作的可行性，将工艺条件修正为反应温度79℃，加酶量6%，反应时间13 h，在该条件下进行了3次验证试验，脂肪酶Lipozyme TL IM催化棕榈硬脂分子内重排反应所得产物中sn-2位棕榈酸含量平均值为58.01%，与理论预测值基本吻合。

图6 反应温度与加酶量交互作用对sn-2位棕榈酸含量影响的响应曲面Fig.6 Response surfaces plot of the effect of interaction of reaction temperature and enzyme load on the palm acid content on the sn-2 position of the products

3 结论

（1）利用Design-Expert软件，通过对棕榈硬脂分子内重排反应工艺的研究，建立了关键因素影响反应产物中sn-2位棕榈酸含量的数学模型，且模型高度显著(P＜0.000 1)，该方程能较好地预测脂肪酶Lipozyme TL IM催化棕榈硬脂分子内重排反应过程中产物中sn-2位棕榈酸的变化。

（2）经响应面法优化得出最优工艺条件为：反应温度为79℃，加酶量为6%，反应时间为13 h，在此条件下得到产物中sn-2位棕榈酸含量为58.01%，得到的甘油三酯可用于制备人乳脂替代品的原料。

图7 反应时间与加酶量交互作用对sn-2位棕榈酸含量影响的响应曲面Fig.7 Response surfaces plot of the effect of interaction of reaction time and enzyme load on the palm acid content on the sn-2 position of the products

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PREPARATION OF TRIGLYCERIDES RICHED IN PALMITIC ACID ON SN-2 POSITION BY ENZYMATIC INTRA-MOLECULAR REARRANGEMENT OF PALM STEARIN

JIANG Zhilei，LIANG Shaohua，NI Changcheng
（School of Food Science and Technology，Henan University of Technology，Zhengzhou 450001，China）

Human milk has special triglyceride structure，the main ingredient is 1，3-di-oleic acid-2-palmitic acid triglyceride (OPO)，which means that palmitic acid is mainly distributed on sn-2 position，while the unsaturated fatty acids such as oleic acid，linoleic acid and linolenic acid were mainly distributed on the sn-1，3 position.The present study was to prepare the triglycerides riched in palmitic acid on sn-2 position，which could be used as raw material for the subsequent human milk fat substitute，by enzymatic intra-molecular rearrangement of palm stearin，while lipase Lipozyme TL IM as catalyst.The content of palmitic acid on sn-2 position was used as the response value，and the effects of reaction factors on the process conditions were investigated by single factor experiment and Box-Behnken experimental response surface analysis.The result showed that the optimum reaction conditions were as follows:reaction temperature of 79℃，reaction time of 13 h and enzyme load of 6%，under which the content of palmitic acid on the sn-2 position of the obtained glycerides could reach to 58.01%，which could meet the requirements of preparation of human milk fat substitute.

palm stearin；lipase；the intra-molecular rearrangement；triglycerides with sn-2 position riched in palmitic acid

TS221

B

1673-2383(2017)03-0018-07

http://kns.cnki.net/kcms/detail/41.1378.N.20170621.1050.008.html

网络出版时间：2017-6-21 10:50:25

2016-08-22

蒋志磊（1990—），男，河南西平人，硕士研究生，主要从事油料加工及其资源综合利用的研究工作。

*通信作者