基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术筛选乙型肝炎肝硬化至肝癌过程中血清标志蛋白的初步研究

王沧海，吴 静，宿 慧，郭春梅，林 琳

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基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术筛选乙型肝炎肝硬化至肝癌过程中血清标志蛋白的初步研究

王沧海，吴 静*，宿 慧，郭春梅，林 琳

目的 应用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)技术分析乙型肝炎肝硬化至肝癌过程中血清标志蛋白的变化，以期发现早期肝癌甚至癌前病变时的血清标志物。方法 选取2010—2012年首都医科大学附属北京世纪坛医院收治的乙型肝炎肝硬化患者240例，对其进行随访，为期3年，每6个月抽血1次，保存血清。其中12例患者在随访过程中确诊为原发性肝癌，2例患者留取血样量不足，仅对10例患者的血样进行分析。对完成随访未进展为肝癌的209例乙型肝炎肝硬化患者按照性别、年龄匹配选取40例。并选取同期本院体检中心健康者的血样40例。应用MALDI-TOF-MS技术分析患者血清蛋白质组学的变化。结果 应用CM10芯片共检测出109个蛋白峰，其中具有差异的蛋白质分子量分别为：4 350.8 Da、6 858.5 Da、7 571 Da、15 125 Da、15 893 Da。其中4 350.8 Da随着肝癌的发生逐渐呈上调趋势，6 858.5 Da、7 571 Da、15 125 Da、15 893 Da随着肝癌的发生呈下调趋势。结论 随着肝癌的发生，分子量为4 350.8 Da的蛋白质呈逐渐上调趋势，其余6 858.5 Da、7 571 Da、15 125 Da、15 893 Da蛋白质呈逐渐下调趋势。

肝肿瘤；肝硬化；光谱法，质量，基质辅助激光解吸电离

王沧海，吴静，宿慧，等.基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术筛选乙型肝炎肝硬化至肝癌过程中血清标志蛋白的初步研究[J].中国全科医学，2017，20(20)：2551-2554.[www.chinagp.net]

WANG C H,WU J,SU H,et al.Proteomic markers of the patients with liver cirrhosis to liver cancer by MALDI-TOF-MS[J].Chinese General Practice,2017，20(20)：2551-2554.

原发性肝癌是世界范围内第二大死亡原因，其中我国患者占50%以上[1]。我国多见于患有慢性乙型肝炎、肝硬化患者，早期诊断原发性肝癌可明显改善患者预后。临床常用的筛查方法是肝脏超声和血清甲胎蛋白(AFP)，AFP>200 μg/L提示肝癌[1]，难以早期诊断。基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)技术是快速鉴定肿瘤标志物的有力工具，本研究拟应用此方法探讨乙型肝炎肝硬化进展为原发性肝癌的患者在疾病进展过程中血清蛋白组的变化特点，以期寻找肝癌早期诊断的方法。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选取2010—2012年首都医科大学附属北京世纪坛医院收治的乙型肝炎肝硬化患者240例，其中男144例，女96例；年龄29～70岁，平均年龄(53.0±10.3)岁。排除原发性肝癌及其他部位肿瘤患者。

1.2 方法 对患者进行随访，随访时间为3年。随访过程中每6个月抽血1次，检测AFP和生化肝功能，并行肝脏超声(必要时腹部增强CT/MRI)确诊肝癌。并同时抽取患者空腹12 h晨起静脉血5 ml，不抗凝，静置1 h，以2 500 r/min离心5 min，离心半径16 cm，提取血清，冻存于-80 ℃。并选取同期本院体检中心健康者40例，其中男30例，女10例；年龄30～75岁，平均年龄(56.1±14.7)岁。

1.3 MALDI-TOF-MS仪器和方法

1.3.1 仪器 美国Ciphergen公司生产蛋白飞行质谱仪(PBS IIc型)，本实验采用化学修饰的CM10芯片。

1.3.2 操作步骤 (1)血清样品处理：从-80 ℃冰箱中取出血清，于4 ℃溶解，以10 000 r/min离心2 min，离心半径16 cm。取3 μl血清样品，加6 μl U9处理液〔9 mol/L尿素，2% CHAPS，1%二硫苏糖醇(DTT)，50 mmol/L Tris-Cl，pH 9.0〕，充分混匀，冰浴振荡30 min后取出，加入108 μl结合缓冲液(50 mmol/L NaAc，pH 4.0)，立即混匀。(2)上样及洗脱：将CM10芯片装入bioprocessor中，每孔加入200 μl结合缓冲液，室温振荡洗涤2次，5 min/次，甩干。每孔分别加入100 μl样品混合液，振荡孵育1 h，甩去样品，用200 μl洗脱缓冲液(50 mmol/L NaAc，pH 4.0)室温振荡洗涤2次，5 min/次，甩干；再用HPLC H2O洗涤1次，立即甩干。拆开bioprocessor，取出芯片，晾干后，每点加2次0.5 μl SPA，晾干后即可上机测量。(3)数据采集：采用Ciphergen Proteinchip 3.1版本的分析软件自动采集数据，采用Biomarker Wizard软件分析实验前后血清的蛋白质指纹图谱差异。

1.4 统计学方法 采用Ciphergen Proteinchip 3.1及Biomarker Wizard软件对数据进行统计学处理，确定各组间蛋白峰值的差异。

2 结果

共221例患者完成3年随访，其中12例患者在随访过程中确诊为原发性肝癌，2例患者留取血样量不足，仅对10例患者的血样进行分析，其中男10例，女2例；平均年龄(47.7±8.2)岁。对完成随访未进展为肝癌的209例乙型肝炎肝硬化患者按照性别、年龄匹配选取40例，其中男35例，女5例；平均年龄(48.8±12.1)岁。应用CM10芯片共检测出109个蛋白峰，其中具有差异的蛋白质分子量分别为：4 350.8 Da、6 858.5 Da、7 571 Da、15 125 Da、15 893 Da(见图1～4)，15 893 Da未生成蛋白质质谱图。其中4 350.8 Da随着肝癌的发生逐渐呈上调趋势，6 858.5 Da、7 571 Da、15 125 Da、15 893 Da随着肝癌的发生呈下调趋势(见图5～9)。

注：横轴为蛋白质分子量，纵轴为蛋白丰度，底部为模拟明胶酶谱

图1 分子量为4 350.8 Da蛋白质质谱图

Figure 1 Mass spectrometry of 4 350.8 Da protein

注：横轴为蛋白分子量，纵轴为蛋白丰度，底部为模拟明胶酶谱

图2 分子量为6 858.5 Da蛋白质质谱图

Figure 2 Mass spectrometry of 6 858.5 Da protein

注：横轴为蛋白分子量，纵轴为蛋白丰度，底部为模拟明胶酶谱

图3 分子量为7 571 Da蛋白质质谱图

Figure 3 Mass spectrometry of 7 571 Da protein

注：横轴为蛋白分子量，纵轴为蛋白丰度，底部为模拟明胶酶谱

图4 分子量为15 125 Da蛋白质质谱图

Figure 4 Mass spectrometry of 15 893 Da protein

图5 分子量为4 350.8 Da蛋白质在肝癌患者中的表达随时间上升

Figure 5 The expression of 4 350.8 Da in HCC patients increased with time

图6 分子量为6 858.5 Da蛋白质在肝癌患者中的表达随时间下降

Figure 6 The expression of 6 858.5 Da in HCC patients decreased with time

图7 分子量为7 571 Da蛋白质在肝癌患者中的表达随时间下降

Figure 7 The expression of 7 571 Da in HCC patients decreased with time

图8 分子量为15 125 Da蛋白质在肝癌患者中的表达随时间下降

Figure 8 The expression of 15 125 Da in HCC patients decreased with time

图9 分子量为15 893 Da蛋白质在肝癌患者中的表达随时间下降

Figure 9 The expression of 15 893 Da in HCC patients decreased with time

3 讨论

蛋白质组学研究常用的MALDI-TOF-MS技术是快速鉴定疾病标志物的一个有力工具，在卵巢癌、前列腺癌、肝癌、肺癌等肿瘤标志物的研究中取得了许多成果。可用血清、脑脊液、乳腺分泌物、组织裂解液等上样，具有快速、高通量、灵敏度高、易操作等特点，尤其对低丰度蛋白质和小分子量蛋白质有较高的检测灵敏度[2]。

ZHU等[3]对25例乙型肝炎病毒(HBV)导致肝硬化患者、20例肝细胞癌(HCC)患者和25例匹配健康人的血清经MALDI-TOF-MS检测，发现2种潜在的生物标志物，分子量分别是7 772 Da和3 933 Da，在肝硬化患者血清中呈下调表现。PARADIS等[4]采用MALDI-TOF-MS分析82例肝硬化伴或不伴肝癌患者的血清发现，有30个蛋白质峰度在两者之间存在差异，经进一步纯化和鉴定发现最高的差异峰是vitronetin的C端。STEEL等[5]分别对健康组、无活动性慢性HBV携带组、有活动性慢性HBV携带组和慢性感染病史组的血清混合进行MALDI-TOF-MS分析，发现与健康组相比，HCC组有2个点在肝癌患者血清中表达丰度是低的，经质量指纹图谱鉴定，分别是补体C3的羧基端和载脂蛋白A1的异形体。

王家祥等[6]应用MALDI-TOF-MS分析肝癌、肝硬化、正常人的血清，并使用人工神经网络的方法进行数据分析，肝癌组和肝硬化组比较，分子量为7 759 Da和13 134 Da的2个蛋白质峰有显著差异，肝癌组与正常人比较，分子量为3 015 Da和5 900 Da的2个蛋白质峰有显著差异，建立人工神经网络后以新样本进行盲法测试，认为利用人工神经网络预测肝癌的总准确率为91.7%、灵敏度为94.6%和特异度为88.2%。黄成等[7]收集135例原发性肝癌患者，根据有无门静脉癌栓分为两组，对其治疗前的血清进行MALDI-TOF-MS分析，检出16个蛋白峰有显著差异，其中分子量为3 478 Da、1 314 Da、1 744 Da、1 725 Da、2 022 Da、3 380 Da蛋白质在门静脉癌栓组上调，而8 901 Da、9 353 Da、9 415 Da、8 773 Da、2 766 Da、2 745 Da、8 697 Da、7 773 Da、8 569 Da、1 373 Da蛋白质在门静脉癌栓组下调，以此建立的决策树模型准确率为87.5%，灵敏度为100.0%，特异度为77.3%，阳性预测值为78.3%，阴性预测值为100.0%。

刘丽杰等[8]筛选HBV相关肝癌血清差异表达蛋白，其中差异最显著蛋白(质荷比为5 805)酶解产物表达水平为：正常人群<慢性肝炎组<肝硬化组<肝癌组。邓敬桓等[9]研究显示，肝癌高发家系组与无癌家系组共有15个蛋白质具有差异，筛选出4个蛋白质峰建立诊断模型的灵敏度为96.0%(24/25)，特异度为88.0%(22/25)，准确率为92.0%。齐义军等[10]应用MALDI-TOF-MS同样可以观察肝癌患者肝动脉化疗栓塞术(TACE)治疗前后蛋白质谱的变化。

与上述研究的区别是，本研究采用CM10芯片检测患者血清蛋白指纹图谱，主要是动态观察在乙型肝炎肝硬化进展至原发性肝癌过程中，患者血清蛋白质谱的动态变化趋势，10例乙型肝炎肝硬化随访过程中出现肝癌的患者历次血清中发生了逐步变化的蛋白质共5种，随肿瘤的发生呈上调或下调状态，由于本研究例数较少，无法建立人工神经网络或决策树模型，仅能初步观察具有变化趋势的蛋白。目前本研究仍有肝硬化患者在进一步随访中，有望将上述5种蛋白在罹患肝癌的患者中得到验证，如能确定其肝癌标志物的地位，可能在以后应用于原发性肝癌的临床早期诊断。

作者贡献：王沧海进行文章的构思与设计、撰写论文；王沧海、吴静进行研究的实施与可行性分析、论文的修订、负责文章的质量控制及审校；宿慧、郭春梅、林琳进行数据收集；王沧海、宿慧、郭春梅、林琳进行数据整理、统计学处理、结果的分析与解释；吴静对文章整体负责，监督管理。

本文无利益冲突。

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[2]HENDERSON N A,STEELE R J.SELDI-TOF proteomic analysis and cancer detection[J].Surgeon,2005,3(6)：383-390,422.

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(本文编辑：贾萌萌)

Proteomic Markers of the Patients with Liver Cirrhosis to Liver Cancer by MALDI-TOF-MS

WANGCang-hai,WUJing*,SUHui,GUOChun-mei,LINLin

DepartmentofGastroenterology,BeijingShijitanHospital,CapitalMedicalUniversity,Beijing100038，China

*Correspondingauthor：WUJing,Chiefphysician;E-mail：wujing36@163.com

Objective To analyze the changes of serum marker proteins in hepatitis B patients from liver cirrhosis to hepatocellular carcinoma by using matrix assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry(MALDI-TOF-MS),in order to detect serum markers of early liver cancer or even precancerous lesions.Methods From 2010 to 2012,a total of 240 patients with hepatitis B cirrhosis admitted to Beijing Shijitan Hospital,Capital Medical University were enrolled.The patients were followed up for 3 years.The blood was extracted once every 6 months and the serum was preserved.Among them,12 patients were diagnosed as primary liver cancer during follow-up.The blood samples of 2 patients were insufficient and only the blood samples of 10 patients were analyzed.40 cases were selected from 209 patients with hepatitis B cirrhosis who completed follow-up without progression to liver cancer according to sex and age.The blood samples of 40 healthy people in the physical examination center during the same period were selected.The serum proteomic changes of patients were analyzed by using MALDI-TOF-MS technique.Results A total of 109 protein peaks were detected by CM10 chip,Among them,the molecular weights of the proteins with significant differences were 4 350.8 Da,6 858.5 Da,7 571 Da,15 125 Da,and 15 893 Da,respectively.And 4 350.8 Da showed a gradually increased trend with the occurrence of liver cancer,and 6 858.5 Da,7 571 Da,15 125 Da and 15 893 Da showed a downward trend with the occurrence of liver cancer.Conclusion With the occurrence of liver cancer,the protein with molecular weight of 4 350.8 Da shows a gradual upward trend,while the proteins with molecular weight of 6 858.5 Da,7 571 Da,15 125 Da,15 893 Da show a gradual downward trend.

Liver neoplasms;Liver cirrhosis;Spectrometry,mass,matrix-assisted laser desorption-ionization

R 735.7

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2017.06.y04

2016-10-29；

2017-04-06)

100038北京市，首都医科大学附属北京世纪坛医院消化内科

*通信作者：吴静，主任医师；E-mail：wujing36@163.com