高效液相色谱法测定补肾养血颗粒中二苯乙烯苷含量

徐冲，刘霞，范智琴，杨敏

（重庆市中医院药剂科，重庆400021）

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高效液相色谱法测定补肾养血颗粒中二苯乙烯苷含量

徐冲，刘霞，范智琴，杨敏

（重庆市中医院药剂科，重庆400021）

目的建立测定补肾养血颗粒中二苯乙烯苷含量的高效液相色谱法。方法色谱柱采用Phenomenex Gemini5u C18柱（250 mm× 4.6 mm，5 m），流动相为乙腈－水（18∶82），流速为1.0 m L/min，检测波长为320 nm，柱温为25℃。结果二苯乙烯苷进样量在0.288～2.304 g范围内与峰面积积分值线性关系良好（r＝0.999 6），平均回收率为96.27%，RSD为1.20%（n＝9）。结论该方法测定结果准确、稳定，重复性好，简便易行，可用于该制剂中二苯乙烯苷的含量测定。

补肾养血颗粒；二苯乙烯苷；含量测定；高效液相色谱法

补肾养血颗粒为我院自制制剂，由制何首乌、熟地黄、菟丝子、桑葚等19味中药组方，具有补肾养血、乌发生发、填精补脑的功效，用于肝肾不足、气血两虚或脾虚生湿所致的脱发，症见毛发松动或呈稀疏状脱落、毛发干燥或油腻、头皮瘙痒，或斑秃、早秃、脂溢性脱发与病后、产后脱发见上述证候者[1]。该方以汤剂形式在我院临床应用10余年，疗效确切，且安全可靠。为方便患者服用，我院拟将其开发为颗粒剂，为进一步提高该制剂质量的可控性和稳定性，保证临床用药安全，根据2015年版《中国药典（一部）》及文献[2－5]，本研究中采用高效液相色谱(HPLC)法测定该制剂中二苯乙烯苷含量，经方法学验证，操作简便，专属性强，重复性好，且阴性对照无干扰。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent－1260型高效液相色谱仪(美国Agilent公司)；AE－200型电子天平（天津Mettler公司），JA3003J型电子密度天平（上海舜宇恒平科学仪器有限公司）；ZNHW－Ⅱ型智能恒温电热套（河南爱博特公司）；KQ3200E型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

1.2 试药

二苯乙烯苷对照品（化学名为2，3，5，4′－四羟基二苯乙烯－2－O－β－D－葡萄糖苷，中国食品药品检定研究院，批号为110844－201411）；补肾养血颗粒（医院自制制剂，批号分别为20150513，20150514，20150515）；乙腈、甲醇均为色谱纯；水为纯化水；其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：PhenomenexGemini5u C18柱（250mm×4.6mm，5μm）；流动相：乙腈－水（18∶82）；流速：1.0 m L/min；检测波长：320 nm；柱温：25℃；进样量：10μL。理论板数按二苯乙烯苷峰计算应不低于2 000。

2.2 溶液制备

对照品溶液：称取二苯乙烯苷对照品适量，精密称定，加稀乙醇制成每1m L含二苯乙烯苷0.36 mg的溶液，即得。

供试品溶液：取本品约15 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入稀乙醇50 m L，称定质量，加热回流30min，放冷，再称定质量，用稀乙醇补足减失的质量，摇匀，静置，取上清液滤过，取续滤液，即得。

阴性对照品溶液：按处方量并以相同工艺制备不含二苯乙烯苷的阴性样品，按供试品溶液制备方法制备阴性对照品溶液。

2.3 方法学考察

系统适用性与阴性干扰试验：将对照品溶液、供试品溶液和阴性对照品溶液在拟订色谱条件下进样测定。结果所测成分与样品中其他组分色谱峰基线分离，阴性对照无干扰。色谱图见图1。

1.二苯乙烯苷A.对照品溶液B.供试品溶液C.阴性对照品溶液图1高效液相色谱图

线性关系考察：精密吸取对照品溶液0.2，0.4，0.8，1.2，1.6m L，置5m L容量瓶中，加稀乙醇稀释至刻度，摇匀。按拟订色谱条件进样测定，记录峰面积，以进样量（X，μg）为横坐标、峰面积积分值（Y）为纵坐标，绘制标准曲线。得二苯乙烯苷回归方程Y＝3 146X＋40.947，r＝0.999 6（n＝5）。结果表明，二苯乙烯苷在0.288～2.304μg范围内与峰面积积分值线性关系良好。

精密度试验：精密吸取同一对照品溶液10μL，连续进样6次，测定峰面积。结果二苯乙烯苷峰面积的RSD为0.83%（n＝6），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：取同一供试品溶液，分别于0，2，4，8，12 h时进样10μL，测定，记录峰面积。结果二苯乙烯苷峰面积的RSD为0.91%（n＝5），表明供试品溶液在12 h内稳定性良好。

重复性试验：取同一批（批号为20150513）样品，分别依法制备供试品溶液6份并测定含量。结果二苯乙烯苷的RSD为1.02%（n＝6），表明方法重复性良好。

加样回收试验：称取已知含量的同一批（批号为20150513，含量为1.680 mg/g）样品约0.5 g，精密称定，共9份，置具塞锥形瓶中，分别精密加入0.36mg/g二苯乙烯苷对照品溶液1.8，2.4，2.8 mL，依法制备供试品溶液，按拟订色谱条件进样测定，计算回收率。结果见表1。

表1 二苯乙烯苷加样回收试验结果（n＝9）

2.4 样品含量测定

取3批样品（批号分别为20150513，20150514，20150515），按拟订方法测定含量，测得二苯乙烯苷含量分别为1.68，1.57，1.74mg/g。

3 讨论

3.1 检测指标成分选择

补肾养血颗粒为我院自制制剂，由制何首乌、熟地黄、菟丝子、桑葚等组方。方中制何首乌具有补肝肾、益精血、乌须发、强筋骨之功效，《本草纲目》谓“何首乌……，能养血益肝，固精益肾，健筋骨，乌髭发，为滋补良药，不寒不燥，功在地黄、天门冬诸药之上”，故为君药。制何首乌主要含有蒽醌类、黄酮类、二苯乙烯苷类、磷脂类、多糖类等化合物[6－8]，其中二苯乙烯苷是制何首乌的主要药效成分之一，具有抗氧化、清除自由基作用，还有较好的抗肿瘤、调血脂、抗动脉粥样硬化作用，保护肝脏、舒张血管、抗衰老和防治老年痴呆等作用[9]。故选择二苯乙烯苷作为含量测定的指标成分。

3.2 流动相选择

曾考察了甲醇－水（25∶75）、乙腈－水（18∶82）、乙腈－0.1%磷酸水（18∶82）等不同流动相系统，结果发现，采用乙腈－水（18∶82）为流动相时分离较好，且柱效较高，故流动相选乙腈－水（18∶82）。

3.3 提取方法选择

分别考察了稀乙醇作为溶剂超声提取和加热回流提取30min方式处理样品，结果稀乙醇加热回流提取30min二苯乙烯苷的含量高于超声提取，故选取加热回流30min。

参考文献：

[1]范智琴.梅花针配合中药治疗脱发80例[J].实用中医药杂志，2005，21(9)：539.

[2]国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[M].北京：中国医药科技出版社，2015：176.

[3]王红，杨慈海，宋军.高效液相色谱法测定补脑安神片中二苯乙烯苷含量[J].中国药业，2016，25(16)：72－74.

[4]高艳彬.生血宝合剂中二苯乙烯苷的含量测定[J].中国药业，2014，23(16)：45－46.

[5]朱兰兰，迟雪洁，孙蓉.益肾乌发口服液中二苯乙烯苷、大黄素、大黄素甲醚的含量测定[J].中国药物警戒，2011，8(5)： 281－283.

[6]蔡丽芬，钟国跃，张倩，等.HPLC测定不同生长年限及采收期何首乌中二苯乙烯苷和蒽醌类成分的含量[J].中国中药杂志，2010，35(10)：1221－1225.

[7]王亭，龚千锋.何首乌炮制后化学成分及药理作用的研究进展[J].中国实验方剂学杂志，2017，23(2):220－226.

[8]高淑红，苏珍枝，肖学凤.制首乌化学成分及药理作用研究进展[J].山西中医学院学报，2012，13(2)：74－77.

[9]汪姣.何首乌中二苯乙烯苷的现代研究[J].中国社区医师：医学专业，2011，13(31)：17－18.

Content Determ ination of Stilbene G lucoside in Bushen Yangxue G ranu les by HPLC

Xu Chong,Liu Xia,Fan Zhiqin,Yang Min
(Chongqing Municipal Hospital of Traditional Chinese Medicine,Chongqing,China 400021)

Objective To establish an HPLC method for the content determination of stilbene glucoside in Bushen Yangxue Granules.M ethods The method was achieved on Phenomenex Gemini 5u C18column(250 mm×4.6 mm,5μm)using acetonitrile－water(18∶82)as mobile phase at a flow rate of 1.0 m L/min,and the detection wavelength was 320 nm,the column temperature was 25℃.Resu lts Stilbene glucoside showed good linear relationship in the range of 0.288－2.304μg(r＝0.999 6).The average recovery rate was 96.27%,RSD＝1.20(n＝9).Conclusion The method is sensitive,accurate and reproducible,which can be used to determine the content of stilbene glucoside in Bushen Yangxue Granules.

Bushen Yangxue Granules;stilbene glucoside;content determination;HPLC

R284.1

A

1006－4931(2017)09－0020－03

2017－02－29)

10.3969/j.issn.1006－4931.2017.09.006

国家中药炮制技术传承基地项目[国中医药科技〔2015〕111号]；重庆市科委基本科研业务费计划项目[cstc2015 jbky330025009]；重庆市科委科技平台与基地建设（内设机构法人化改革)[cstc2015pt－kjyfsf0019]。

徐冲（1982－），男，主管中药师，研究方向为中药药效物质基础与活性评价，（电话）023－67063732（电子信箱）loran587＠aliyun.com。

杨敏（1969－），男，主任中药师，研究方向为中药炮制与制剂，（电话）023－67063732（电子信箱）cqyangmin＠126.com。