动态浊度法测定注射用阿莫西林钠克拉维酸钾细菌内毒素含量

李慧，张彦丽，崔晓燕，刘琳，刘云

(1.河北省石家庄市食品药品检验中心，河北石家庄050031；2.河北省药品检验研究院，河北石家庄050011)

·检验检测·

动态浊度法测定注射用阿莫西林钠克拉维酸钾细菌内毒素含量

李慧1，张彦丽1，崔晓燕2，刘琳1，刘云1

(1.河北省石家庄市食品药品检验中心，河北石家庄050031；2.河北省药品检验研究院，河北石家庄050011)

目的建立测定注射用阿莫西林钠克拉维酸钾细菌内毒素含量的方法。方法按照2015年版《中国药典（四部）》，采用动态浊度法进行干扰试验，测定样品中细菌内毒素的含量。结果当供试品稀释质量浓度为60 g/L时，无干扰作用，细菌内毒素回收率为50%～200%。结论动态浊度法定量检测样品中细菌内毒素，细菌内毒素含量均远低于药典规定的0.25 EU/mg，现有标准可作进一步提高。

注射用阿莫西林钠克拉维酸钾；细菌内毒素；动态浊度法

注射用阿莫西林钠克拉维酸钾是阿莫西林钠和克拉维酸钾的复方制剂，是临床应用广泛的抗菌药物[1]，对β－内酰胺酶流感嗜血杆菌和卡他莫拉菌所致下呼吸道感染均具有有效的抑制作用[2]，可用于治疗多种感染性疾病。目前，阿莫西林钠克拉维酸钾复合制剂的应用越来越普及，甚至超过了单用阿莫西林[3]。另外，其为静脉滴注，为了保障患者的用药安全，对其进行细菌内毒素控制有实际意义。细菌内毒素最常用的检查法一般是鲎试剂试验法[4]，现行标准用凝胶法进行检查，为限量检查法，不能准确测定样品中的细菌内毒素含量。细菌内毒素动态浊度法[5－6]以凝胶试验为基础，通过标准曲线对样品中内毒素含量进行定量测定[7－9]。参照2015年版《中国药典（四部）》[10]细菌内毒素检查法中的动态浊度法，以建立更灵敏、准确的细菌内毒素定量检测方法。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

64 well Kinetic Tube Reader光度试管仪（英国莱伯金耐特有限公司），TM－1FN型自动漩涡混合器（日本三洋公司）。

1.2 试药

细菌内毒素工作标准品(中国食品药品检定研究院，批号为150601－201580，规格为每支80 U）；动态浊度法鲎试剂(批号为1505080，规格为1.25 m L，检测范围为10～0.03 EU/m L）；鲎试剂（批号为1505080，规格为0.1m L，灵敏度为0.25 EU/m L）；BET用水（批号为1503250，规格为5m L），均由湛江安度斯生物有限公司提供。注射用阿莫西林钠克拉维酸钾（H生产企业，批号分别为078160551，078160552，078160553）。

2 方法与结果

2.1 细菌内毒素限值（L）的确定

按照2015年版《中国药典》规定，L＝K/M，其中K为人用每1 kg体质量每1 h最大可接受的内毒素剂量，K＝5 EU/(kg·h）；M为人用每1 kg体质量每1 h最大供试品剂量，根据说明书，每1 h内可能的最大给药剂量为1.2 g，人均体质量按60 kg计算，L定为0.25 EU/mg为宜，与药典规定一致。

2.2 标准曲线的建立和可靠性分析

取细菌内毒素标准品1支，用BET用水溶解并进行稀释，使其最终浓度分别为2.0，0.5，0.125，0.031 25 EU/m L，分别取0.1mL加至预先加有0.1m L动态浊度法鲎试剂的反应管内，混合均匀，插入动态试管仪内进行检测，其中每一浓度平行加3管，同时用BET用水作为阴性对照。以平均反应时间的对数（lg T）为纵坐标，内毒素浓度的对数值（lgC）为横坐标，制作标准曲线。结果见表1。

结果表明，标准曲线回归方程为lg T＝2.811 7－0.241 1 lgC，相关系数(r)＝－0.9952(绝对值应＞0.980)。平行管之间的变异系数均小于2%，阴性对照反应时间大于标准曲线最低浓度的反应时间，细菌内毒素标准曲线成立。

2.3 干扰试验

取供试品(批号为078160551，规格为1.2 g)，加BET用水10 mL溶解，制成质量浓度为120 g/L的溶液，将其稀释2，10，20，50倍备用（A液）；制备含0.5 EU/m L（λm）内毒素的不同稀释倍数的供试品溶液（B液）；同时制备0.031 25，0.125，0.5，2.0 EU/mL内毒素溶液（C液）；阴性对照管为BET用水（D液）。分别取上述溶液各0.1 m L加入预先加有0.1m L试剂的反应管中，每一浓度平行加2管，混匀，立即置Kinetic Tube Reader光度试管仪进行检测，结果见表2。

表1 细菌内毒素标准曲线与可靠性分析结果

表2 供试品干扰试验结果

表4 凝胶法细菌内毒素检查结果

供试品在稀释质量浓度为60，12，6，2.40 g/L的条件下，回收率为50%～200%，供试品稀释浓度为60 g/L时，回收率表现最好，且内毒素检测值准确计算，能更好地反映供试品细菌内毒素含量情况，故选择稀释质量浓度为60 g/L为检测质量浓度。取批号为078160551，078160552，078160553的供试品，依法检测，结果见表3。

2.4 凝胶法细菌内毒素检查

根据干扰试验结果，采用0.25 EU/mL鲎试剂，根据公式C＝λ/L，将供试品溶液稀释至1 g/L，采用凝胶法进行细菌内毒素检查。结果见表4。

3 讨论

动态浊度法是在凝胶法基础上发展起来的细菌内毒素定量检测方法。目前，复合制剂在临床的应用越来越广泛，诸如输液反应等也广受关注，动态浊度法定量测定复合制剂中细菌内毒素含量为其临床应用提供了可靠参考[11]。此方法灵敏度高，操作便捷，一方面，检测范围较凝胶法宽，准确定量，重复性好，可实时观察与分析干扰试验和样品检测情况；另一方面，节约检验成本，简化操作环节，提高检测效率。这些优势使该方法在药品细菌内毒素检测的应用中日益普遍。

本研究中采用动态浊度法定量测定注射用阿莫西林钠克拉维酸钾中细菌内毒素的含量，试验中样品在不同稀释质量浓度下，细菌内毒素回收率均在50%～200%。采用动态浊度法能准确检测样品中细菌内毒素含量，且样品溶液在高质量浓度就能排除干扰测得定量数据，稀释倍数高于现行标准，能准确测定注射用阿莫西林钠克拉维酸钾中细菌内毒素含量。因此，本研究建立的注射用阿莫西林钠克拉维酸钾内毒素定量检测方法可行。

通过采用动态浊度法测定不同生产厂家样品中细菌内毒素含量，比较各样品的内毒素含量差异，可进一步比较不同厂家的生产工艺及控制方法，可进一步提升现有标准。

[1]梁丽文.注射用阿莫西林钠克拉维酸钾溶液的稳定性分析[J].求医问药（下半月），2013，11（1）：190.

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Content Determ ination of Bacterial Endotoxin in Am oxicillin Sodium and Clavulanate Potassium for Injection by K inetic Turbidim etric M ethod

Li Hui1,Zhang Yanli1,Cui Xiaoyan2,Liu Lin1,Liu Yun1
(1.Shijiazhuang Institute for Food and Drug Control,Shijiazhuang,Hebei,China 050031; 2.Hebei Provincial Institute for Drug Control,Shijiazhuang,Hebei,China 050011)

Ob jective To establish a method for determining the content of bacterial endotoxin in Amoxicillin Sodium and Clavulanate Potassium for Injection.M ethods According to the Chinese Pharmacopoeia 2015 Edition fourth section,kinetic turbidimetric method was used for the interference test of Amoxicillin Sodium and Clavulanate Potassium for Injection and determining the content of bacterial endotoxin in samples.Results The interference was eliminated when the sample was diluted to 60 g/L,the recovery rate of bacterial endotoxin was within 50%－200%.Conclusion Dynamic turbidimetry can be used for bacterial endotoxin in test of Potassium Clavulanate and Amoxicillin for Injection,the content of bacterial endotoxin is less than the standard of Chinese Pharmacopoeia 0.25 EU/mg, and the current standard can be further improved.

Amoxicillin Sodium and Clavulanate Potassium for Injection;bacteria endotoxin;kinetic turbidimetric method

R446.5

A

1006－4931(2017)09－0026－03

2016－11－23；

2017－02－04)

10.3969/j.issn.1006－4931.2017.09.008

李慧(1982－)，女，硕士研究生，主管药师，研究方向为药理学及药物分析，（电子信箱）190635814＠qq.com。