苯系污染物微生物降解及其合成聚羟基脂肪酸酯的研究进展

倪宇洋，黄顺生，张勇，徐兵，洪森荣

(1.上饶师范学院 生命科学学院，江西 上饶 334001；2.江苏省地质调查研究院， 江苏 南京 210018)



苯系污染物微生物降解及其合成聚羟基脂肪酸酯的研究进展

倪宇洋1，黄顺生2，张勇1，徐兵1，洪森荣1

(1.上饶师范学院 生命科学学院，江西 上饶 334001；2.江苏省地质调查研究院， 江苏 南京 210018)

苯系物在挥发性有机废气( VOCs)中常见，且毒性强、难消除，一旦泄漏，将造成严重的水、土壤、大气全面的环境污染。微生物治理苯系污染物以其操作条件温和、运行费用低、净化效果好、安全性能高、二次污染小等特点受到世界各国广泛关注。苯系污染物微生物治理是将苯系物在微生物作用下转换为无害物质的过程，而微生物则起到了至关重要的作用。对降解苯系物的微生物种类、代谢途径，以及其资源化利用等方面进行概述，以洞悉当前存在问题及发展趋势。

苯系污染物；微生物；生物降解；聚羟基脂肪酸酯

苯系物是一类含苯环结构的芳香族化合物，其中苯(Benzene)、甲苯(Toluene)、乙苯(Ethylbenzene)、二甲苯(Xylene)最为常见，合称为BTEX。它们大量存在于石油及其炼制的产品中，也可作为有机溶剂，被广泛应用于合成农药、高分子塑料和油漆等。由于苯环的稳定性、挥发性、毒性，以及使用的广泛性等原因，使得它们成为长期环境问题的主要污染源，在污染环境中这类物质常被称之为苯系污染物[1-2]。消除其对环境的污染，已成社会关注的热点，其中微生物处理技术被认为是最经济实效的方式[3-4]。近些年，微生物利用苯系物合成PHA的研究也取得积极进展。全方面了解降解苯系物的微生物种类，降解代谢途径以及研究现状，可为苯系污染物的微生物治理与资源化利用提供思路与方法，有重要意义。

1 苯系污染物的防治现状

苯系类物质被美国、欧洲等许多西方国家明确界定为致癌物质，它们常被用于衡量环境污染程度的重要指标,同时也是被要求最优处理的污染物[5-6]。鉴于苯系物对环境污染的严重性，我国在各环境监测项目中：《地表水环境质量标准》(GB 3838-2002)、《污水综合排放标准》(GB 8978-1996)、《室内空气质量标准》(GB/T18883.2002)，也都将苯系物含量纳入为重要的污染参数。然而，在苯系污染物的防治方面，由于这类污染具有隐蔽性、长期性以及对其认识的滞后性，使得对这类污染物的防治工作并不理想。据美国环境保护署(USEPA)估计，在其地下160余万个储油罐中，约有20%都存在不同程度的原油泄漏问题，并且在许多城市的大气中，苯系物也时常被检测出[7]。事实上，在我国原油泄漏的问题也屡见不鲜，例如：2011年，大连石化厂区爆炸事件；2012年，北京通州区石油管道发生泄漏事件；2013年，广东湛江石油管道泄漏事件；2014年，兰州自来水苯超标事件；2015年，吉林石化分公司的双苯厂爆炸事件等等，几乎每年都有类似事件发生。我国空气中苯系物污染问题也较为突出，夏芬美[8]等对北京市东北城区环境空气中VOCs进行了在线监测分析，结果表明其空气中苯系物含量达10.36 μg·m-3，其中BTEX占所有苯系物含量的72%。由此可见，苯系物的污染具有普遍性，且目前其防治效果不尽如人意。

2 苯系物的微生物降解

2.1 降解苯系物的微生物种类

降解苯系物的微生物种类具多样性，在原核微生物界与真核微生物界均有存在。真核微生物降解苯系物的菌株多为好氧型霉菌，代表性的菌株有Phanerochaetechrysosporium[9],Cladosporiumsphaerospermum[10],Paecilomycesvariotii[11]等。原核微生物降解苯系物的菌株多为细菌，而根据对氧的需求，又可将其分为好养型降解细菌与厌氧型降解细菌，代表性的革兰氏阴性好养菌有：Pseudomonas[12]、Delftia[13]、Acinetobacter[14]、Sphingomonas[15]和Alcaligenes[16]等菌属；代表性的革兰氏阳性好养菌有Rhodococcus[17]和Mycobacterium[18]等。在好氧型微生物降解苯系物的过程中，氧气不仅起到电子受体的作用，同时还作为反应底物参与苯系物的降解。而厌氧型的苯系物降解菌则需在化能作用下才能完成降解苯系物的过程，当以硝酸盐作为电子受体的苯系物降解菌，它们多为Thauera[19]或Azoarcus[20]菌属；以Mn4+、Fe3+金属离子作为电子受体进行苯系物降解的细菌在Geobacteraceae[21]菌属中见有报道；Rabus等[22]还报道了Desulfosporosinus菌属可在硫酸盐还原条件下降解苯系物。另外，许多苯系物的降解是通过微生物所携带的质粒完成的[23]，这类质粒往往可以在微生物间传递，这使得降解苯系物的微生物更具多样与变化。

2.2 微生物降解苯系物的代谢途径

2.2.1 好氧代谢途径

降解苯系物的微生物种类多样，其相应的降解途径也呈多样性。而在好养环境中，均通过氧化酶的参与将其裂解与利用，主要的途径可以分为两个大的阶段。第一阶段为该类物质在氧化酶的作用下转化成邻苯二酚，或其结构类似物；而后一阶段为邻苯二酚在裂解酶的作用下将苯环裂解，进而被微生物生长所利用。好养微生物能否有效降解苯系物，主要由第一阶段的加氧酶羟基化过程决定，该过程根据加氧酶的特性不同，可在苯环上或苯环侧链上进行。在苯系物中，甲苯的结构特性满足了不同类型加氧酶的作用要求，因此甲苯能被不同苯系物降解菌的加氧酶羟基化，即甲苯能被所有的好养苯系物降解菌降解。图1即为甲苯的生物降解途径。

图1 微生物中甲苯的有氧代谢途径[24]

在该好氧降解过程中，第一阶段的氧化途径呈现出多样性[25]，其被发现的氧化酶有TDO(Toluene Di-oxygenase)，XMO (Xylene Mono-oxygenase)，T2MO (Toluene 2 Monoxygenase)，T3MO (Toluene 3 Monoxygenase)，T4MO (Toluene 4 Monoxygenase)；后一阶段用于苯环裂解的酶主要为C12DO (Catechol 1，2 di-xylgenase) 和C23DO (Catechol 2，3 di-xylgenase)。对于菌株个体而言，一般同一菌株仅含有一条有效的降解途径，换言之，同一菌株很难做到同时降解所有的苯系化合物。

2.2.2 厌氧代谢途径

苯系物的厌氧降解过程也可分为两个大的阶段：外周降解与中心降解。厌氧菌首先需经外周降解途径将苯系类化合物转化成苯甲酰-辅酶A或其结构类似物，而后通过中心代谢途径将其彻底降解。其主要过程见图2。

图 2 苯系物的厌氧降解途径[26]

相比于其它苯系物，苯由于不存在侧链基团，因此成为厌氧降解过程中较难降解的化合物。迄今仅有少数的几篇报道提及过苯的厌氧降解过程[27]。通过追踪降解过程中的中间代谢产物，发现苯的降解也是通过外周降解过程先转化成苯甲酸，继而转化成苯甲酰-辅酶A。苯甲酰-辅酶A其苯环在苯甲酰-辅酶A还原酶与ATP的合力作用下，先形成自由基中间体1,5-环己二烯-1-羟基辅酶A，而后在二烯烃辅酶A水合酶作用下在双链位置加入羟基转化为6-羟基-1-己烯-1-羰基辅酶A，再通过微生物进一步转化成乙酰辅酶A进入三羧酸循环，供菌体代谢使用。

3 苯系污染物的微生物治理

3.1 苯系物的水污染修复

苯系物对地表水的污染主要由化工厂的废水排放引起，而地下水源的苯系物污染主要来自于储油罐或输油管道的泄漏。地表水苯系物污染可通过好氧菌的曝气处理达到修复的目的，赵同强等[28]利用缓释曝气生物膜处理技术对河水中的苯系物进行了修复研究，结果表明，当水中苯系物浓度控制在50～100 mg·L-1时，处理24 h后，苯系物含量降至5 mg·L-1以下，苯系物去除率达90%以上。地下水苯系物的污染，由于其缺氧环境，采用厌氧微生物修复被认为是较为理想的选择。Mester和Kosson[29]利用反硝化细菌对含甲苯的地下水进行处理，甲苯的降解率也可达90%以上。

3.2 苯系物的大气污染防治

苯系物的大气污染要从源头上进行防治，要严格把控苯系物向大气中的排放标准。近些年我国针对挥发性有机废气污染物制定了《石油炼制工业污染物排放标准》(GB31570-2015)、《石油化学工业污染物排放标准》(GB31571-2015)、《合成树脂工业污染物排放标准》(GB31571-2015)等一系列国家标准，在高标准的政策引导下，苯系物大气污染的防治工作受到极大的关注。孙珮石等[4]在生物滴虑塔中通过生物膜填料方式，对再生胶废气进行了初步工业应用研究，结果表明微生物净化废气中的甲苯效果良好，运行稳定，当甲苯进气质量浓度控制在100～1 000 mg·m-3时，净化后出气口的甲苯质量浓度均低于60 mg·m-3可达到国家排放标准。

3.3 苯系物的土壤污染治理

由于土壤的吸附特性, 泄漏在土壤中的苯系物除了挥发至空气和迁移至水体中，还有部分会残留在土壤中并逐渐积累[30]。对土壤的苯系物污染进行微生物治理，其方法可分为原位与异位修复两大类。原位修复技术指不将污染土壤搬离原址，而在原地进行污染消除等作业，Hwang等[31]就通过向污染土壤中投送微生物培养液，对苯系物降解取得了良好效果。异位修复技术则是将污染土壤移出并通过人工设备(例如：预制床、泥浆生物反应器等)进行污染消除作业，Eullis等[32]就利用预制床结合滤液收集和水循环系统，对防腐油生产区的土壤进行了有效治理，土壤中多环芳烃类苯系物质量分数从1 024.4 mg·kg-1降至324.1 mg·kg-1,效果显著。

4 苯系物为碳源的聚羟基脂肪酸酯合成

在研究微生物治理苯系污染物的基础上，苯系污染物的资源化探索，在近十年中取得了一定的突破。Hori[33]团队和Trautwein[34]团队分别发现Rhodococcusaetherivorans和Aromatoleumaromaticum菌可利用甲苯为碳源在胞内积累短链聚羟基脂肪酸酯(short-chain-length Polyhydroxyalkanoates, SCL-PHAs)；Nikodinovic团队于2008年报道了Pseudomonasputida在以BTEX这类苯系物为碳源合成中长链聚羟基脂肪酸酯(medium-chain-length Polyhydroxyalkanoates, MCL-PHAs)的研究成果[35]。其实，由于苯系物的强挥发性与毒性的作用，以苯系污染物为碳源进行菌株的大规模稳定培养是十分困难的，上述研究中的PHA产能均十分有限(质量浓度不足0.2 g·L-1)。为实现稳定高效的微生物培养，我们在该方向上做了大胆的创新与突破，开发了新型的碳源限制性气态流加补料系统，实现了纯菌株的大量稳定培养，将PHA产能提高了十余倍(质量浓度可达2.2 g·L-1)[36]，该研究结果表明，微生物在以甲苯为碳源，合成PHA的产能，可以达到与使用其它碳源相当的水平，这使得苯系污染物应用于PHA的生产有了理论基础。

目前，合成PHA的苯系物降解菌多为好氧菌，结合苯系物好氧降解与PHA合成的代谢途径，微生物以苯系物为碳源合成PHA的代谢过程，可概括为图3。苯系类物质通过有氧降解开环后形成乙酰辅酶A，微生物在营养不均衡条件下(例如缺N环境)会将多余的乙酰辅酶A用于PHA的合成。其PHA合成途径可分为两条，其一为乙酰辅酶A在β-酮基硫解酶(PhaA)的作用下缩合成乙酰乙酰辅酶A，而后在乙酰乙酰辅酶A还原酶(PhaB)的作用下被还原成3-羟基丁酰辅酶A单体，最后短链PHA聚合酶(PhbC)将单体聚合成SCL-PHA；另一条为乙酰辅酶A通过脂肪酸的合成途径(denovosynthesis)先形成中间代谢产物 (R)-3-羟基脂酰-ACP，再通过(R)-3-羟基脂酰-ACP：CoA酰基转移酶(PhaG)的作用下形成中长链PHA单体(R)-3-羟基脂酰辅酶A，最后中长链PHA合酶(PhaC1或PhaC2)将(R)-3-羟基脂酰辅酶A单体聚合成MCL-PHA。当然，含有长侧链脂肪酸基团的苯系物(例如：苯己酸、苯庚酸、苯辛酸、苯壬酸等)其苯环结构可不被降解，而直接通过侧链脂肪酸基团的β-氧化途径形成中间代谢产物(R)-苯烯脂酰辅酶A，再通过(R)-烯脂酰辅酶A水合酶(PhaJ)的作用下形成中长链PHA单体(R)-3-羟基苯脂酰辅酶A，该单体中苯环结构依旧存在，因此最后也可在中长链PHA合酶(PhaC1或PhaC2)作用下聚合成含苯环结构的MCL-PHA[37]。

5 前景及展望

微生物将苯系物降解并转化成聚羟基脂肪酸酯(PHA)，可在消除污染的同时实现变废为宝的双重功效，因此有着更为广阔的应用前景。但环境中苯系污染物类型多样，且常同时存在，而微生物通常仅能降解部分苯系物，这使得微生物治理苯系污染物的普适性较差。基于增强其与现实应用的对接能力，以下几方面还需进一步深入研究：

1)快速响应的分子检测技术与优质菌种资源的富集筛选技术开发。根据不同地的苯系污染物特征，建立起快速响应检测技术可及时发现和掌握苯系物污染的情况；菌种资源快速富集筛选是针对特定污染源的，可增强菌种应用中的适应能力。

图3 不同底物合成PHA的代谢途径

2)苯系物降解混菌系与基因工程菌的开发。自然界中微生物种类多样，而目前被鉴定筛选出的微生物占总比不到10%，这是公认的事实，跳出传统纯化培养菌种观念，开发稳定高效的苯系物降解混菌系，是扩大菌种底物利用范围的有效方式之一。基因工程是随着近现代分子生物技术的发展而兴起的又一技术手段，基因工程菌的开发也能有效扩大底物利用范围。

3)工艺与设备的改进。微生物治理苯系污染物技术虽工艺简单、对设备要求低，但工艺设备的改进对提升微生物降解苯系物的效能却十分显著，正如我们利用改进的碳源补料策略成功实现PHA的高产一样，这方面的积极介入可能会起到事半功倍的效果。

4)综合治理技术的开发。苯系污染物在生产各环节中都有可能产生，微生物治理技术多用于治理，与其它技术手段(物理、化学法等)综合使用，将防污与治污放在同等重要位置，做到防中有治，治中有防，防治结合，这应是未来技术发展的新趋势。

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Research Progress on Biodegradation of BTEX and Synthesis of Polyhydroxyalkanoates

NI Yuyang1, HUANG Shunsheng2, ZHANG Yong1, XU Bing1, HONG Senrong1

(1. School of Life Science, ShangRao Normal University，Shangrao Jiangxi 334001, China; 2. Geological Survey of Jiangsu Province, Nanjing Jiangsu 210018, China)

BTEX is common among volatile organic compounds (VOCs). It is very toxic, difficult to remove, and will cause severe water, soil, air pollution once being leaked. That microorganism controls the BTEX pollutants attracts the whole world’s attention for gentle manipulating condition, low operating costs, good removing effects, high safety, and small second pollution. It utilizes microorganism to convert BTEX to harmless substances, and microorganism plays a essential role in this process. We review bacterial species and pathways of degrading BTEX, and BTEX resource utilization. Current problems and developing tendency of this technology are also reviewed.

BTEX; microorganism; biodegradation; polyhydroxyalkanoates

2017-03-29

江西省教育厅科技项目(GJJ161058);博士科研启动基金(001061)

倪宇洋(1983-)，男，江西婺源人，讲师，博士，主要从事环境微生物学研究。E-mail:wnyy@163.com

X172

A

1004-2237(2017)03-0096-07

10.3969/j.issn.1004-2237.2017.03.019