羟基自由基与腺嘌呤初始反应机理的理论研究

彭奎霖，吴丽丹，曹璐璐，胡兵

(上饶师范学院 化学与环境科学学院，江西 上饶 334001)



羟基自由基与腺嘌呤初始反应机理的理论研究

彭奎霖，吴丽丹*，曹璐璐，胡兵

(上饶师范学院 化学与环境科学学院，江西 上饶 334001)

为了解细胞衰老、死亡、癌变等方面的问题，理解导致DNA损伤反应的机理非常重要。其中非常重要的一类导致DNA氧化损伤的反应是羟基自由基(·OH)氧化腺嘌呤A和其他碱基。利用量子化学从头算的方法研究了腺嘌呤A与·OH初始反应机理。综合考虑反应产物的稳定性以及反应的能垒，腺嘌呤A与·OH的初始反应最可能是·OH夺取腺嘌呤A的N(6)H，其次是·OH加成到腺嘌呤A的C(8)位。计算所得结果可为实验提供理论指导，为实验上腺嘌呤A与·OH反应机理的提出指明方向。

羟基自由基；腺嘌呤；加成反应；夺氢反应；反应机理

细胞DNA包含复杂的遗传信息。为了信息传递的正确性，生物体必须保持DNA结构的完整性。而正常代谢过程以及外界环境都可能损伤DNA。当DNA损伤累积到一定程度时，DNA的损伤就不能被修复，导致细胞衰老、死亡和癌变，最终表现为老化、神经症状和癌症。

作为一个反应活性非常强的氧化剂，羟基自由基(·OH)在化学、生物学、医药和大气与环境科学领域受到了广泛的关注。在生物学上，生物体内产生的活性氧自由基(ROS)会导致DNA、蛋白质和脂质的氧化损伤[1-3]，而其中·OH是公认的反应活性最强和危害最大的活性氧自由基。癌症，关节炎和帕金森综合征就是与·OH有关的一些疾病[1]。在细胞的组成成分当中DNA对·OH的氧化最为敏感。DNA由磷酸、戊糖、碱基三部分组成，其中碱基最容易受到·OH氧化损伤。在DNA的四种碱基(鸟嘌呤G、腺嘌呤A、胸腺嘧啶T、胞嘧啶C)中，鸟嘌呤G由于氧化电位最低[4]，最容易受到·OH损伤。因此文献中有大量研究集中在·OH与G碱基反应的机理[5-7]，已经有比较统一的结论。腺嘌呤A是四种碱基中第二容易受到·OH损伤的[8]，因此也引起了人们的兴趣[9-13]。实验研究认为·OH首先加成到A碱基的C4=C5以及N7=C8双键上，生成C(4)、C(8)加成产物A4OH·、A8OH·[9-12]。其中C(4)加成产物A4OH·占81%，进一步脱水生成中性自由基A(-H)·。C(8)加成产物A8OH·占18%，进一步开环生成FAPyA。对于A与·OH的理论研究，Schaefer等人[13]计算了·OH夺取A碱基上各位点H的能垒。在理论上并没有A与·OH加成反应的研究。

因此，为了明确腺嘌呤A与·OH的初始反应机理究竟是加成还是夺氢，在本文中我们通过量子化学理论计算，在B3LYP/6-311++G(d, p)水平上计算了腺嘌呤A与·OH发生加成反应、以及夺氢反应的路径，得到了C(4)加成、C(8)加成、以及夺取不同位点氢的能垒。结果表明腺嘌呤A与·OH的初始反应最可能是·OH夺取腺嘌呤A的N(6)H，其次是·OH加成到腺嘌呤A的C(8)位。

1 理论计算方法

腺嘌呤A与·OH发生加成反应、夺氢反应的反应物、过渡态、中间体及产物的结构及能量都在HF、M062X、及B3LYP 方法6-31+G(d)基组及 B3LYP/6-311++G(d, p)水平下进行了全优化。本体系涉及17个原子，其中6个重原子，在考虑计算效率的情况下，B3LYP/6-311++G(d, p)能提供可靠的计算结果。所有的驻点通过频率分析证明其所有频率都为正，而过渡态则有唯一虚频。并且所有的过渡态通过内禀反应坐标(IRC)[14]加以确认。为了考虑溶剂的影响，计算得到的能量利用连续介质模型(PCM)[15]进行校正。所有的计算都是利用Gaussian 09程序包[16]完成。

2 结果与讨论

腺嘌呤A与·OH发生加成反应和夺氢反应所涉及的反应物、过渡态、中间体及产物的结构如图1～图6所示，HF/6-31+G(d)，M062X/6-31+G(d)和B3LYP/6-31+G(d)方法给出相似的结果。以C(4)加成(路径A)和夺取C(2)氢(路径G)为例，在不同水平上计算得到的反应能量如表1所示。HF方法计算得到的能量偏大，相对来说B3LYP和M062X提供了较为可信的结果。B3LYP方法计算得到的能量和M062X方法计算得到的结果很相似，因此可以认为B3LYP方法能够给出准确的结果。为了得到更精确的能量，反应所涉及的中间体及过渡态用了B3LYP/6-311++G(d, p)这种精度相对较高的方法进行计算。在本文中讨论的构型及能量也都是来自B3LYP/6-311++G(d, p)方法计算得到的结果。

表1 腺嘌呤A与·OH反应计算所得的能量 kJ·mol-1

2.1 腺嘌呤A与·OH加成反应

腺嘌呤A与·OH可发生C(4)加成和C(8)加成反应(如图1所示)，所涉及的反应物、过渡态、中间体及产物的结构如图2所示。在C(4)加成中(路径A)，腺嘌呤A首先与·OH形成复合物RA，能量下降9.4 kJ/mol。随后，经过过渡态TSA，·OH加成到腺嘌呤A的C(4)位，形成C(4)加成产物PA。跨越过渡态TSA需要的能量(ΔE)在B3LYP/6-311++G(d, p)水平上计算得到为26.4 kJ/mol，产物PA比反应物能量低33.2 kJ/mol。在C(8)加成中(路径B)，腺嘌呤A首先与·OH形成复合物RB，能量下降35.2 kJ/mol。随后，经过过渡态TSB，·OH加成到腺嘌呤A的C(8)位，形成C(8)加成产物PB。跨越过渡态TSB需要的能量(ΔE)在B3LYP/6-311++G(d, p)水平上计算得到为20.3 kJ/mol，产物PB比反应物能量低118.2 kJ/mol。

2.2 腺嘌呤A与·OH夺氢反应

腺嘌呤A上总共有5个氢原子：N(6)位2个氢原子、C(2)位1个氢原子、C(8)位1个氢原子，N(9)位1个氢原子(如图3所示)。从腺嘌呤A与·OH结构出发，有6条路径可生成夺氢产物(如图3所示)，所涉及的反应物、过渡态、中间体及产物的结构如图4～图6所示。在这6条路径中，·OH夺取腺嘌呤A氢原子的过程类似：腺嘌呤A首先与·OH形成复合物，然后经过一个夺氢过渡态，·OH夺取腺嘌呤A氢原子，形成脱氢产物A(-H)·与H2O。

图1 腺嘌呤A与·OH加成反应机理示意图

图2 B3LYP/6-311++G (d, p)方法计算得到腺嘌呤A与·OH发生C(4)加成(路径A)及C(8)加成(路径B)反应的相对势能曲线。括号里为PCM模型校正能量

B3LYP/6-311++G (d, p)方法计算得到·OH夺取腺嘌呤N(6)位两个氢原子(路径C及路径D)的相对势能曲线如图4所示。在这两条路径中，腺嘌呤A与·OH形成的复合物(RC及RD)能量分别比反应物的低17.4 kJ/mol和35.2 kJ/mol，跨越夺氢过渡态(TSC及TSD)需要的能量(ΔE)分别为8.2 kJ/mol和14.1 kJ/mol，产物(PC及PD)能量比反应物的分别低78.3 kJ/mol和85.2 kJ/mol。

图3 腺嘌呤A与·OH夺氢反应机理示意图

图4 B3LYP/6-311++G (d, p)方法计算得到·OH夺取腺嘌呤N(6)位氢原子(路径C及路径D)的相对势能曲线。括号里为PCM模型校正能量

B3LYP/6-311++G (d, p)方法计算得到·OH夺取腺嘌呤C(8)位氢原子(路径E)及N(9)位氢原子(路径F)的相对势能曲线如图5所示。在这两条路径中，腺嘌呤A与·OH形成的复合物(RE及RF)能量都比反应物的低34.4 kJ/mol，跨越夺氢过渡态(TSE及TSF)需要的能量(ΔE)分别为45.9 kJ/mol和17.2 kJ/mol，产物(PE及PF)能量比反应物的分别低38.9 kJ/mol和94.4 kJ/mol。

B3LYP/6-311++G (d, p)方法计算得到·OH夺取腺嘌呤C(2)位氢原子(路径G及路径H)的相对势能曲线如图6所示。在这两条路径中，腺嘌呤A与·OH形成的复合物(RG及RH)能量分别比反应物的低31.8 kJ/mol和34.4 kJ/mol，跨越夺氢过渡态(TSG及TSH)需要的能量(ΔE)分别为29.2 kJ/mol和31.8 kJ/mol，产物(PG及PH)能量比反应物的分别低64.8 kJ/mol和70.0 kJ/mol。

图5 B3LYP/6-311++G (d, p)方法计算得到·OH夺取腺嘌呤C(8)位氢原子(路径E)及N(9)位氢原子(路径F)的相对势能曲线。括号里为PCM模型校正能量

图6 B3LYP/6-311++G (d, p)方法计算得到·OH夺取腺嘌呤C(2)位氢原子(路径G及路径H)的相对势能曲线。括号里为PCM模型校正能量

由以上结果可知，腺嘌呤A与·OH发生加成或夺氢反应得到的产物能量都比反应物能量低，说明反应放热，所计算的加成及夺氢反应都有可能发生。在这些产物中，C(8)加成产物最稳定(-118.2 kJ/mol)，其次是夺取N(9)H产物(-94.4 kJ/mol)，紧接着是夺取N(6)H的产物(-85.2 kJ/mol)。众所周知，反应能否发生，反应速率的快慢由反应能垒决定。从反应能垒角度考虑，·OH夺取腺嘌呤N(6)H的能垒最低(8.2 kJ/mol)，其次是C(8)加成(20.3 kJ/mol)。因此，腺嘌呤A与·OH的初始反应最可能是·OH夺取腺嘌呤A的N(6)H，其次是·OH加成到腺嘌呤A的C(8)位。实验上认为腺嘌呤A与·OH的主要反应是C(4)加成，其次是C(8)加成，并且C(4)加成产物会进一步脱水生成脱氢产物A(-H)·。我们注意到，·OH夺取腺嘌呤A的N(6)H的产物亦是脱氢产物A(-H)·，因此，实验产物A(-H)·有可能不是通过C(4)加成-脱水途径而得，而是·OH直接夺取腺嘌呤氢原子而得。因此，计算结果与实验结果并不矛盾。

3 结论

利用量子化学从头算的方法计算了腺嘌呤A与·OH发生C(4)、C(8)加成反应及夺取N(6)H、C(2)H、C(8)H、N(9)H反应的路径。反应所涉及的反应物、中间体、过渡态及产物利用HF/6-31+G(d)、 M062X/6-31+G(d)、B3LYP/6-31+G(d) 和 B3LYP/6-311++G(d, p)方法进行了优化，并利用以上方法对每一条反应路径的能量进行了计算。计算结果显示所有反应都放热，都有发生的可能。根据产物能量，C(8)加成产物最稳定(-118.2 kJ/mol)，其次是夺取N(9)H产物(-94.4 kJ/mol)，紧接着是夺取N(6)H的产物(-85.2 kJ/mol)。根据反应能垒，·OH夺取腺嘌呤N(6)H的能垒最低(8.2 kJ/mol)，最容易发生；其次是C(8)加成(20.3 kJ/mol)。因此，腺嘌呤A与·OH的初始反应最可能是·OH夺取腺嘌呤A的N(6)H，其次是·OH加成到腺嘌呤A的C(8)位。

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Mechanism of Adenine Reaction with Hydroxyl Radical: A Theoretical Study

PENG Kuilin, WU Lidan, CAO Lulu, HU Bing

(School of Chemistry and Environmental Science, Shangrao Normal University, Shangrao Jiangxi 334001， China)

In order to address problems such as aging, cell death, and cancer, it is important to understand the mechanisms behind reactions causing DNA damage. One specific reaction implicated in DNA oxidative damage is hydroxyl radical attack on adenine (A) and other nucleic acid bases. In the present study, initial mechanisms of adenine reaction with hydroxyl have been investigated by theoretical calculations. Considering the stability of product and reaction energy barrier, the initial reaction of adenine and hydroxyl radical is most likely to be N(6)H abstraction, followed by C(8) addition. The results obtained can provide theoretical instruction for the experiment, and offer guidance for the proposition of mechanisms of adenine reaction with hydroxyl based on experiment.

hydroxyl radical; adenine; addition reaction; H abstraction reaction; reaction mechanism

2016-12-08

上饶师范学院大学生创新训练项目(2016-CX-11)；江西省教育厅科技项目(GJJ161061)

彭奎霖(1996-)，男，江西吉安人，上饶师范学院化学与环境科学学院材料化学专业学生。

*通讯作者：吴丽丹,E-mail：wulidan1987@iccas.ac.cn

O625.61

A

1004-2237(2017)03-0084-06

10.3969/j.issn.1004-2237.2017.03.017