肺泡灌洗液含铁血黄素细胞染色技术改良

马兴生，张晓琦，刘光福，杨国儒

(潍坊呼吸病医院检验科，山东潍坊 261041)

·临床检验技术研究·

肺泡灌洗液含铁血黄素细胞染色技术改良

马兴生，张晓琦，刘光福，杨国儒

(潍坊呼吸病医院检验科，山东潍坊 261041)

目的 比较不同含铁血黄素细胞染色技术并选择最佳者。方法 将同一位肺泡出血患者肺泡灌洗液在相同条件下制成4份涂片标本，分别用常规法、改良法1、改良法2、传统法染色。在同一显微镜下观察100个肺巨噬细胞，计数含铁血黄素细胞。结果 4种染色法每100个肺巨噬细胞计数的含铁血黄素细胞分别为23、52、51和48。结论 除常规法，其他3种方法检出含铁血黄素细胞数差别不大，改良法1可最大限度地提高含铁血黄素细胞检测的准确性且临床实用性强，推荐改良法1。

肺泡灌洗液；含铁血黄素细胞；染色技术

肺组织内出血时红细胞被巨噬细胞吞噬，并在其溶酶体内降解，形成光镜下可见的棕黄色颗粒，即含铁血黄素；这种巨噬细胞被称为含铁血黄素(巨噬)细胞。检测肺泡灌洗液中含铁血黄素细胞对肺出血性疾病具有诊断价值[1-2]。含铁血黄素细胞是诊断特发性肺含铁血黄素沉着症(idiopathic pulmonary hemosiderosis，IPH)的特异性指标[3-4]。在临床检验工作中，受染色技术影响，含铁血黄素细胞有时不易辨认，计数差异较大。本研究通过比较肺泡灌洗液含铁血黄素细胞不同染色技术，力求寻找简便易行的染色技术，提高含铁血黄素细胞的检测效率和准确性。

1 材料与方法

1.1 仪器与设备 DM2500型光学显微镜(德国LEICA公司)，SC-3610型低速离心机(安徽中科中佳公司)，HYC-310型医用冷藏箱(青岛海尔特种电器公司)，MS3 BS25型漩涡振荡器(德国IKA公司)，HAILUN牌病理级高级载玻片(南通海伦生物公司)，13×78硬质透明试管(扬州创新医疗器械厂)，Laixu牌12×100塑料试管(中国淄博来绪公司)，300目尼龙滤网(昆山鑫泰筛网滤网公司)，瑞氏-吉姆萨染色液(珠海贝索公司)，浓盐酸(广州德树公司)，伊红(上海试剂三厂)，亚铁氰化钾(山东莱阳经济技术开发区精细化工厂)。

1.2 标本采集 2017年2月于我院呼吸内科就诊某患者，采集支气管肺胞灌洗液约30 mL于支气管肺胞灌洗专用无抗凝剂硅塑瓶(减少细胞粘附)中并送检。标本外观无色、微混浊。细胞计数2.00×104/mL。

1.3 方法

1.3.1 染液配制 酸性亚铁氰化钾染液：取适量200 g/L亚铁氰化钾溶液，逐滴加入浓盐酸，至溶液刚出现均匀混浊，再逐滴加入适量200 g/L亚铁氰化钾溶液，至白色浑浊刚刚消失(200 g/L亚铁氰化钾与浓盐酸比例大约是5∶1)[5]。

瑞氏-吉姆萨试剂：用1 g瑞氏染料、0.3 g吉姆萨染料、500 mL甲醇配制A液；B液为pH值(25 ℃)6.6～6.8磷酸盐缓冲液。

1.3.2 4种染色法 常规法：瑞氏-吉姆萨染色法：(1)取一张涂片加瑞氏-吉姆萨试剂A液适量，覆盖整个涂片膜，染色0.5～1.0 min；(2)再加2～3倍B液，洗耳球吹匀，染色6～8 min；(3)水洗、干燥，显微镜下计数100个肺巨噬细胞中含铁血黄素细胞。

改良法1：在常规法染色基础上，滴加酸性亚铁氰化钾染液，覆盖整个涂片膜，室温染色20 min，充分水洗、干燥，显微镜下计数100个肺巨噬细胞中含铁血黄素细胞。

改良法2：(1)取一张涂片，滴加酸性亚铁氰化钾染液，覆盖整个涂片膜，室温染色20 min，充分水洗，干燥。(2)用常规法染色。(3)水洗、干燥，显微镜下计数100个肺巨噬细胞中含铁血黄素细胞。

传统法：(1)取一张涂片，滴加酸性亚铁氰化钾染液，覆盖整个涂片膜，室温染色20 min，充分水洗，干燥。(2)用2%伊红复染0.5 min，(3)水洗、干燥，显微镜下计数100个肺巨噬细胞中含铁血黄素细胞。

2 结果

常规法染色结果见图1A，显微镜下可见胞浆内有棕黄色含铁血黄素颗粒的含铁血黄素细胞；每100个肺巨噬细胞有23个含铁血黄素细胞。改良法1染色结果见图1B，显微镜下可见含铁血黄素细胞变成蓝色或亮蓝色，与背景色形成鲜明对比，易于肉眼分辨；每100个肺巨噬细胞有52个含铁血黄素细胞。改良法2染色结果见图1C，含铁血黄素细胞变成蓝色或亮蓝色，与背景色形成鲜明对比；每100个肺巨噬细胞有51个含铁血黄素细胞。传统法染色结果见图1D，显微镜下观察可见橘黄色背景下蓝色的含铁血黄素细胞，与背景色对比鲜明；但除含铁血红素细胞外，其他细胞结构、形态不易辨别；每100个肺巨噬细胞有48个含铁血黄素细胞。

注：A～D分别为常规法、改良法1、改良法2和传统法。

图1 含铁血黄素细胞4种染色法结果(×1 000)

3 讨论

含铁血黄素细胞内含有三价铁离子，与酸性亚铁氰化钾发生普鲁氏蓝反应呈现蓝色，即铁染色阳性。肺巨噬细胞中只有含铁血黄素细胞铁染色阳性，其他肺巨噬细胞铁染色阴性，所以铁染色阳性细胞即含铁血黄素细胞。通过计数铁染色阳性的细胞即可得含铁血黄素细胞数。常规法、改良法1、改良法2、传统法4种方法，每100个肺巨噬细胞中含铁血黄素细胞分别是23、52、51和48。从数值来看，常规法数值最小，说明在瑞氏-吉姆萨染色中，含铁血黄素细胞的辨认有一定困难，需要的技术门槛较高，且需对含铁血黄素细胞具有较高的辨识能力和敏感性，但难免漏检部分含铁血黄素细胞，影响计数准确性。其他3种染色方法，检出的含铁血黄素细胞数值相近，准确性较高，对技术门槛要求较低。对比改良法1、改良法2，2种方法仅是瑞氏-吉姆萨染色和铁染色顺序的颠倒，结果显示无论改良法1或2，含铁血黄素细胞均被染成清晰明亮的蓝色，说明染色顺序颠倒并不影响实验结果。对比改良法1、2与传统法，传统法用伊红染色后，染色背景呈红色，对铁染色弱阳性肺巨噬细胞的辨认有干扰，易造成计数值偏低。从临床操作角度来看，改良法1优于改良法2。由于并不是所有患者都存在肺出血风险，也并不是所有患者肺泡灌洗液都有含铁血黄素细胞，所有涂片均先铁染色，再瑞氏-吉姆萨染色，不免浪费大量人力、物力；而改良法1，先瑞氏-吉姆萨氏染色，若发现可疑的含铁血黄素细胞后再铁染色，能够最大限度提高含铁血黄素细胞计数的针对性和准确性，节省人力、物力。

综上所述，通过比较上述4种染色法，改良法1最简便高效，值得推荐。此外，鉴于含铁血黄素细胞对肺出血性疾病的重要诊断价值，提倡有条件的实验室，用瑞氏-吉姆萨氏染色观察细胞形态并分类细胞计数后，可加做铁染色，特别是有疑似含铁血黄素细胞时，尽可能提高含铁血黄素细胞的检出率，避免漏诊。

[1]姚雯颖,曹广亚,周道银.肺泡灌洗液检出含铁血黄素细胞辅助诊断肺出血-肾炎综合征[J].实验与检验医学,2008,26(6):628.

[2]Maldonado F, Parambil JG, Yi ES,etal. Haemosiderin-laden macrophages in the bronchoalveolar lavage fluid of patients with diffuse alveolar damage [J]. Eur Respir J, 2009,33(6):1361-6.

[3]牟向东,宿利,聂立功,等.成人特发性肺含铁血黄素沉着症二例报道及文献回顾[J].北京大学学报(医学版),2008,40(6):595-599.

[4]Zhang X, Wang L, Lu A,etal. Clinical study of 28 cases of paediatric idiopathic pulmonary haemosiderosis [J]. J Trop Pediatr, 2010,56(6):386-90.

[5]阳朝. 肺含铁血黄素巨噬细胞检测方法和临床意义[J].医学科技，1986，1(1):152-154.

(本文编辑：王海燕)

10.13602/j.cnki.jcls.2017.06.11

马兴生，1965年生，男，主管技师，主要从事临床检验工作。

杨国儒，主任医师，E-mail：yangguoru@163.com。

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2017-02-28)