野木瓜果汁非酶褐变复配抑制剂的优化

崔霖芸 -

(遵义医药高等专科学校基础部，贵州 遵义 563000)

野木瓜果汁非酶褐变复配抑制剂的优化

崔霖芸CUILin-yun

(遵义医药高等专科学校基础部，贵州 遵义 563000)

为优化野木瓜果汁非酶褐变复配抑制剂配比，通过单因素试验，选择并确定EDTA-Na2、D-异抗坏血酸钠、L-半胱氨酸、柠檬酸4种抑制剂及其水平，以褐变抑制率为响应变量，采用Box-Behnken设计响应面试验方案。利用Design Expert 8.0软件得到回归模型并进行响应面分析，确定野木瓜果汁非酶褐变复配抑制最优配比为：EDTA-Na20.001 1%、D-异抗坏血酸钠0.212 6%、L-半胱氨酸0.543 4%、柠檬酸0.191 7%，该复配抑制剂的抑制率为77.14%。

野木瓜果汁；非酶褐变；抑制；复配

野木瓜(StanuntoniaChinensis)是中国传统中药材，主要分布于华东、华中及西南等地。味酸性温，具有舒筋活络、和胃化湿的功效[1]，被用于治疗哮喘、感冒、咽喉痛、风湿性关节炎及肝炎等[2]。现代研究[3-4]表明野木瓜具有多种生物活性和药理作用，如免疫调节、抗炎镇痛、抗肿瘤、抗菌和抗氧化作用。贵州省遵义市正安县盛产野木瓜，因其独特的地理环境，正安野木瓜具有果大、皮薄、气香、味酸的特点，富含黄酮、酚类、糖类、有机酸和多种维生素与矿物质，品质优良[5-6]。野木瓜除了制成片剂药用外，在食品加工中的运用也较多，常见的加工品有野木瓜干、糕糖、野木瓜酒、醋等，其中野木瓜果汁是能最大程度保留野木瓜优良营养品质与风味的产品。但是野木瓜果汁在储存过程中易发生褐变，严重影响了果汁产品的观感和独特风味，造成产品品质丧失(如色变、风味丧失和营养损失等)[7]，缩短了产品保质期，成为野木瓜果汁生产的主要制约因素[8]。

果汁褐变分为酶促褐变和非酶褐变。酶促褐变可通过钝化多酚氧化酶和降低氧浓度得到较好控制，而非酶褐变由于化学反应复杂，中间产物众多，最终产物也十分复杂，所以较难控制。已报道[9-15]采用的化学抑制剂种类众多，如抗坏血酸、植酸、柠檬酸、L-半胱氨酸、谷胱甘肽等。研究[16]表明，复合抑制剂的抑制效果优于单一抑制剂，复合抑制剂不但可以协调各个抑制剂的最佳浓度，还可以发挥抑制剂间的相互协同作用，如低浓度的半胱氨酸能显著抑制抗坏血酸的降解。许鹏丽等[17]研究了巴西甜橙汁的抗褐变剂，显示亚硫酸钠(0.000 8%)和抗坏血酸(0.050%)对橙汁褐变有明显抑制作用。李鹏等[18]发现0.2%的D-异抗坏血酸钠、0.02%的L-半胱氨酸和0.01%的亚硫酸氢钠混合抑制剂可以有效抑制柿子汁的非酶褐变。寇天舒等[19]则提出无花果汁复合护色剂的最佳组合为4 g/L VC+4 g/L柠檬酸+0.75 g/L EDTA-Na2。目前对于野木瓜果汁非酶褐变复配抑制优化的研究尚未见报道。

本研究拟在前期野木瓜汁非酶褐变的主要影响因素及其权重研究的基础上，针对主要褐变因素筛选出最优褐变抑制剂，通过传统的单因素法找到各抑制剂的最优浓度，再采用响应面法优化抑制剂配方工艺，以期为解决野木瓜汁非酶褐变问题提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

野木瓜：产于贵州省遵义市正安县；

L-半胱氨酸：生化试剂，天津市科密欧化学试剂有限公司；

D-异抗坏血酸钠：含量98%，国药集团化学试剂有限公司；

EDTA-Na2(乙二胺四乙酸二钠)、柠檬酸、焦性没食子酸等：分析纯，国药集团化学试剂有限公司；

数显恒温水浴锅：HH-2型，江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司；

高速冷冻离心机：H-1850R型，长沙湘仪离心仪器有限公司；

榨汁机：JYZ-V902型，山东九阳股份有限公司；

微波炉：Galanz WD900TL23型，广东顺德格兰仕微波炉有限公司；

精密酸度计：PHS-2F型，上海雷磁仪器厂；

紫外可见分光光度计：UV-1801型，北京北分瑞利分析仪器有限公司。

1.2 工艺流程

野木瓜鲜果挑选→清洗→去皮去核切块→微波灭酶→榨汁→添加抑制剂→杀菌→装瓶→成品

1.3 操作要点

1.3.1 微波灭酶 本试验研究的是非酶褐变，因此需将野木瓜片在800 W的微波中灭酶50 s。

1.3.2 榨汁 将野木瓜片榨汁后，离心(4 000 r/min，10 min)，得上清液。

1.3.3 单一褐变抑制剂的抑制作用 根据预试验的筛选结果，选定4种野木瓜果汁非酶褐变抑制剂：EDTA-Na2、L-半胱氨酸、D-异抗坏血酸钠、柠檬酸，考察单一褐变抑制剂的抑制作用。

(1) EDTA-Na2的抑制作用：设置EDTA-Na2的添加量(质量浓度)为0.000 1%，0.000 5%，0.001 0%，0.001 5%，0.002 0%，0.002 5%，0.003 0%，不添加其它抑制剂，考察EDTA-Na2的添加量对野木瓜果汁非酶褐变的抑制作用。

(2)D-异抗坏血酸钠的抑制作用：设置D-异抗坏血酸钠的添加量(质量浓度)为0.01%，0.05%，0.10%，0.20%，0.30%，0.40%，0.50%，不添加其它抑制剂，考察D-异抗坏血酸钠的添加量对野木瓜果汁非酶褐变的抑制作用。

(3)L-半胱氨酸的抑制作用：设置L-半胱氨酸的添加量(质量浓度)为0.01%，0.5%，0.10%，0.30%，0.50%，0.80%，1.10%，不添加其它抑制剂，考察L-半胱氨酸的添加量对野木瓜果汁非酶褐变的抑制作用。

(4) 柠檬酸的抑制作用：设置柠檬酸的添加量(质量浓度)为0.01%，0.05%，0.10%，0.20%，0.30%，0.40%，0.50%，不添加其它抑制剂，考察柠檬酸的添加量对野木瓜果汁非酶褐变的抑制作用。

1.3.4 响应面法优化复合褐变抑制剂 选定EDTA-Na2、D-异抗坏血酸钠、L-半胱氨酸、和柠檬酸4种抑制剂为因素，褐变抑制率为响应变量。采用Box-Behnken设计试验。

1.3.5 数据分析处理 试验数据用Design Expert 8.0软件处理。

1.4 野木瓜果汁非酶褐变抑制率的测定方法

非酶褐变中间产物在420 nm波长处有最大吸收[20]，故在420 nm波长下测定样品的吸光值，按式(1)计算样品的褐变抑制率[18]。

(1)

式中：

I——抑制率，%；

Ai——添加抑制剂的褐变度；

A0——未添加抑制剂的褐变度。

2 结果和讨论

2.1 野木瓜果汁非酶褐变抑制的单因素试验

2.1.1 EDTA-Na2的抑制作用 由图1可知，当加入EDTA-Na2时，对野木瓜汁的褐变有明显的抑制作用，EDTA-Na2添加量增加至0.001 0%时抑制率接近最大值，此后抑制率变化幅度不大。分析原因可能是野木瓜果汁中微量的铜、铁等金属离子具有调节氧化还原电位的作用，而EDTA-Na2是一种金属螯合剂，常温下易与铁、铜、钙等金属离子螯合而使其转变成不活泼的水溶性络合物，从而抑制其氧化和电子传递的作用[21]。因此，刚添加EDTA-Na2时，由于其螯合铜、铁等金属离子，所以抑制作用明显增加，但由于野木瓜果汁中铜、铁等金属离子含量很少，随着EDTA-Na2浓度的增大，野木瓜果汁中铜、铁等金属离子逐渐被螯合殆尽，故抑制作用无明显变化，因此在响应面试验中将EDTA-Na2浓度水平定为0.001 0%。

2.1.2D-异抗坏血酸钠的抑制作用 由图2可知，D-异抗坏血酸钠对野木瓜果汁的褐变抑制作用随着果汁中D-异抗坏血酸钠浓度的增加而显著增加，当浓度增加到0.200%后，抑制作用虽略有上升但变化趋于平缓；当浓度超过0.400%后，抑制作用反而下降。D-异抗坏血酸是L-抗坏血酸的同分异构体，性质与抗坏血酸相似，但其氧化还原电位比L-抗坏血酸还要低，是理想的抗氧化保护剂[22]。韩希凤[23]的研究显示抗坏血酸是非酶褐变的重要因素，本课题组的前期研究结果表明，野木瓜汁非酶褐变的主要因素是多酚和抗坏血酸。因此加入D-异抗坏血酸钠能有效保护多酚和抗坏血酸，从而抑制非酶褐变。但抗坏血酸在高浓度下自身又容易氧化生成红色或黄色的色素[24-25]，增加了褐变度，因此抑制曲线后端略微下降。根据结果确定响应面试验中将D-异抗坏血酸钠浓度水平定为0.200%。

图1 EDTA-Na2对非酶褐变的抑制作用Figure 1 Effect of EDTA-Na2 on the inhibition of non-enzymatic browning

图2 D-异抗坏血酸钠对非酶褐变的抑制作用Figure 2 Effect of sodium D-isoascorbate on the inhibition of non-enzymatic browning

2.1.3L-半胱氨酸的抑制作用 由图3可知，前期L-半胱氨酸对野木瓜果汁非酶褐变的抑制作用随着其浓度的增加而迅速增加，L-半胱氨酸浓度为0.500%时抑制率可达到56.43%，但此后增速放缓，并逐渐趋于水平，这可是得益于L-半胱氨酸的巯基中的硫原子。赵国华等[26]的研究发现含巯基氨基酸对非酶褐变也具有强烈的抑制作用，以同样摩尔数添加，其效果与亚硫酸盐近似。含巯基氨基酸对非酶褐变的抑制作用主要归功于其巯基硫原子极化形成的空轨道重叠后亲核作用增强，在亲核加成反应中—SH的反应速率比—NH2高200～300倍，使羰基化合物首先与—SH加成而抑制美拉德反应，从而降低褐变度[27]。随着L-半胱氨酸的增加，羰基化合物因与—SH加成而逐渐减少，L-半胱氨酸的抑制率趋于水平。因此在响应面试验中把L-半胱氨酸浓度水平定为0.50%。

2.1.4 柠檬酸的抑制作用 由图4可知，柠檬酸对野木瓜果汁的非酶褐变抑制作用随其浓度的增加而增加，在达到0.200%时变化趋于平缓。柠檬酸的抑制作用可能是因其分子结构中有3个羧基，可以和金属离子螯合，另外柠檬酸酸性较强，能有效降低果汁的pH值，而非酶褐变在低pH值下较难发生[8]。由于野木瓜果汁本身具有一定的酸度，所以柠檬酸对野木瓜果汁非酶褐变抑制作用弱于其它因素，因此，根据结果在响应面试验中将柠檬酸浓度水平定为0.200%。

图3 L-半胱氨酸对非酶褐变的抑制作用Figure 3 Effect of L-cysteine on the inhibition of non-enzymatic browning

图4 柠檬酸对非酶褐变的抑制作用Figure 4 Effect of citric acid on the inhibition of non-enzymatic browning

2.2 复合抑制剂对野木瓜果汁非酶褐变的抑制

2.2.1 响应面法对抑制剂参数最优化 根据单因素试验结果，以EDTA-Na2、D-异抗坏血酸钠、L-半胱氨酸和柠檬酸为自变量，以褐变抑制率作为响应变量，应用响应面法，优化复合抑制剂抑制野木瓜果汁非酶褐变的最佳工艺配方。试验方案及结果见表1、2。

2.2.2 回归模型的拟合 采用 Design Expert 8.0软件对表2试验结果进行多元回归拟合，得到野木瓜果汁非酶褐变抑制率对EDTA-Na2、D-异抗坏血酸钠、L-半胱氨酸和柠檬酸四因素的二次多项式回归方程为：

(2)

表1 响应面法试验方案Table 1 Program of response surface analysis

表2 响应面法试验结果Table 2 Experimental results of response surface analysis

2.2.3 响应面图形分析 图5是根据二次多项式回归方程作出的各因素与响应值的响应面和等高线图，可直观地反应各因素及其交互作用对响应值的影响。从等高线可以看出，EDTA-Na2与D-异抗坏血酸钠、L-半胱氨酸的交互作用显著，D-异抗坏血酸钠与L-半胱氨酸、柠檬酸的交互作用也显著，而柠檬酸与EDTA-Na2、L-半胱氨酸的交互作用不显著。图5(b)、(d)、(f)响应曲面坡度较大，尤其是随着L-半胱氨酸添加量的增加，抑制作用变化明显，即沿L-半胱氨酸这一侧曲面坡度较大，表明L-半胱氨酸对野木瓜果汁非酶褐变抑制影响较为强烈，是野木瓜果汁非酶褐变抑制的主要因素，这与单因素试验结果相吻合。在单因素试验中，L-半胱氨酸的单因素抑制作用明显高于其它因素。另一方面在图5(b)、(d)、(f)中可看出L-半胱氨酸在浓度较大时曲线略有向下弯曲，即曲面为斗篷状，其原因可能在于L-半胱氨酸对其它因素的交互影响上，比如有文献[16]指出，如低浓度的半胱氨酸能显著抑制抗坏血酸的降解，可能随着浓度增加，其抑制作用减弱，抗坏血酸氧化增加了褐变度，如图5(d)曲面在L-半胱氨酸高浓度区域向下弯曲明显高于图5 (b)、(f)。通过Design Expert 8.0软件处理，得到野木瓜果汁非酶褐变复配抑制的最优配比为(各因素在果汁中的质量浓度)：EDTA-Na20.001 1%、D-异抗坏血酸钠0.212 6%、L-半胱氨酸0.543 4%、柠檬酸0.191 7%，在此工艺条件下对野木瓜果汁非酶褐变的抑制率为77.14%。为验证预测模型可靠性，以最优工艺条件做验证实验，通过3组平行实验测得实际抑制率为(77.43±0.11)%，与预测值吻合率达99.62%，证明该模型有效。

表3 响应面方差分析表†Table 3 ANOVA for Response Surface Quadratic Model

† *表示显著P<0.05，**表示极显著 P<0.01。

3 结论

(1) 试验结果证实含巯基氨基酸对非酶褐变具有较强抑制作用，可以替代亚硫酸盐，此外，复合抑制剂抑制效果明显优于单一抑制剂。

(2) 本研究应用响应面法得到野木瓜果汁非酶褐变复配抑制的最佳配比为(质量浓度)：EDTA-Na20.001 1%、D-异抗坏血酸钠0.212 6%、L-半胱氨酸0.543 4%，柠檬酸0.191 7%，在此工艺条件下对野木瓜果汁非酶褐变的抑制率为77.14%。以此工艺做验证实验测得实际抑制率为77.43%，与预测值高度吻合，证明此褐变抑制优化工艺有效，具有实用价值。

图5 两因素交互作用对褐变抑制率的响应曲面图Figure 5 Response surface of the interactive effects of empirical factor on the inhibition rate of non-enzymatic browning

(3) 野木瓜果汁非酶褐变反应复杂，需要进一步研究其反应机理，以便进一步优化褐变抑制剂，提高抑制率。此外，复配抑制剂对野木瓜果汁非酶褐变有较好的抑制作用，但对其品质保全如何还需作进一步研究，如研究其风味、抗氧化性功能等。

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Study on the Optimization of the Compound Inhibitor of Non-enzymatic Browning inStanuntoniachinensisjuice

(BasicDepartmentofZunyiMedicalandPharmaceuticalCollege,Zunyi,Guizhou563003,China)

To optimize the compound inhibitor of the non-enzymatic browning inStanuntoniachinensisjuice, four inhibited single factor experiments, i.e., EDTA-Na2(X1), SodiumD-isoascorbate (X2),L-cysteine (X3) and Citric Acid (X4), were used as the independent variables, while the non-enzymatic browning inhibition rate (Y) was regarded as the dependent variable. Moreover, the response surface experiments were undertaken by Box-Behnken design and process the data by Expert 8.0. With the Response Surface Methodology (RSM), the optimal inhibited process parameters of non-enzymatic browning in theS.chinensisjuice was found to be combination of 0.001 1% EDTA-Na2, 0.212 6% SodiumD-isoascorbate, 0.543 4%L- cysteine and 0.191 7% citric acid. In that condition, the inhibition rate was 77.14%.

StanuntoniaChinensisjuice; non-enzymatic browning; inhibition; Compound

10.13652/j.issn.1003-5788.2017.04.036