丁苯酞对β淀粉样蛋白诱导新生SD大鼠海马神经元凋亡的影响

杨宇　贾真　何来鹏　刘广雁

【摘要】 目的：探讨丁苯酞对β-淀粉样蛋白（β-amyloid protein，Aβ）诱导新生SD大鼠海马神经元凋亡的保护作用。方法：将培养的大鼠海马神经元细胞分成Aβ组、Aβ+丁苯酞组和对照组三组，其中Aβ组采用20 μmol/L Aβ处理24 h；Aβ+丁苯酞组先采用10 μmol/L丁苯酞处理30 min后再加入20 μmol/L Aβ處理24 h；对照组不进行任何处理。检测各组海马神经元凋亡、诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）表达情况。结果：（1）MTT检测结果：Aβ组和Aβ+丁苯酞组OD570均显著低于对照组（P<0.05），Aβ+丁苯酞组OD570显著高于Aβ组（P<0.05）。Aβ组和Aβ+丁苯酞组相对于对照组的海马相神经元对存活率分别为48.15%、69.13%。（2）海马神经元细胞凋亡情况：Aβ组和Aβ+丁苯酞组海马神经元细胞凋亡率分别为（50.38±5.32）%和（25.87±2.66）%，均显著高于对照组的（1.24±0.17）%，而Aβ组海马神经元细胞凋亡率显著高于Aβ+丁苯酞组（P<0.05）。（3）Western Blotting结果：Aβ组、Aβ+丁苯酞组和对照组iNOS相对表达量分别为（1.92±0.18）、（0.98±0.12）和（0.37±0.08），Aβ组和Aβ+丁苯酞组iNOS相对表达量均显著高于对照组，Aβ组iNOS相对表达量显著高于Aβ+丁苯酞组（P<0.05）。结论：丁苯酞能够有效抑制Aβ造成的大鼠海马神经元细胞的凋亡作用，降低iNOS表达水平，减少自由基产生和毒性作用。

【关键词】 丁苯酞； β淀粉样蛋白； 海马神经元； 凋亡

Effects of Butylphthalide onβ-amyloid Protein Induced Apoptosis in Hippocampal Neurons of Neonatal SD Rats/YANG Yu，JIA Zhen，HE Lai-peng，et al.//Medical Innovation of China，2017，14（17）：034-037

【Abstract】 Objective：To investigate the protective effect of Butylphthalide onβ-amyloid protein（Aβ） induced apoptosis in hippocampal neurons of neonatal SD rats.Method：Cultured rat hippocampal neuron cells were divided into Aβ group，Aβ+Butylphthalide group and the control group，Aβ group with 20 μmol/L Aβ 24 h，Aβ+Butyphthalide group with 10 μmol/L Butylphthalide treatment 30 min after adding 20 μmol/L Aβ

24 h，the control group without any treatment.The apoptosis of hippocampal neurons and the expression of inducible nitric oxide synthase（iNOS） in three groups were detected.Result：（1） The results of MTT test：OD570 of Aβ group and Aβ+Butyphthalide group were significantly lower than that of the control group（P<0.05），OD570 of Aβ+Butyphthalide group were significantly higher than that of Aβ group （P<0.05）.Compared with the control group，the survival rate of hippocampal neurons in Aβgroup and Aβ+Butyphthalide group were 48.15% and 69.13%.（2）Hippocampal neurons apoptosis：cell apoptosis rate of hippocampal neurons of Aβ group and Aβ+Butyphthalide group were （50.38±5.32）% and （25.87±2.66）%，significantly higher than （1.24±0.17）% of the control group，Aβ group was significantly higher than that of Aβ+Butyphthalide group（P<0.05）.（3）Western Blotting results：iNOS relative expression of Aβ group，Aβ+Butyphthalide group and the control group were （1.92±0.18），（0.98±0.12） and （0.37±0.08）， Aβ group and Aβ+Butyphthalide group were significantly higher than that of the control group，Aβ group was significantly higher than that of Aβ+Butyphthalide group（P<0.05）.Conclusion：Butylphthalide can effectively inhibit apoptosis of cells in rat hippocampal neurons caused by Aβ，decrease the expression level of iNOS，reduce the production of free radicals and toxicity.

【Key words】 Butyphthalide； Amyloid beta protein； Hippocampus； Apoptosis

First-authors address：Department of Geriatrics of Guangdong Medical University，Zhanjiang 524000，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2017.17.009

阿爾茨海默症（Alzheimer disease，AD）是老年痴呆最常见的种类，约占老年痴呆的59%[1]。AD是一种以进行性认知功能减退和日常生活能力下降为临床表现的神经变性疾病，神经元丢失、神经元纤维缠结和神经元外老年斑等是AD最主要的病理特点[2-3]。老年斑的形成是由于β-淀粉样蛋白（β-amyloid protein，Aβ）在神经元细胞外异常沉积有关，Aβ沉积能够直接造成神经元细胞死亡，并激活胶质细胞进而释放炎症因子，加剧神经变性作用[4-5]。基于此，目前治疗AD的重要手段即是采用药物减少Aβ的产生，并促进已经沉积的Aβ发生降解，主要药物药品包括布洛芬、吲哚美辛、17-β雌二醇等[6]。丁苯酞（dl-3-n-butylphthalide）是目前常用的急性缺血性卒中的治疗药物，该药能够改善神经元细胞线粒体功能，消除氧自由基，提高细胞内抗氧化酶活性，降低谷氨酸释放，抑制血小板聚集反应，从而实现改善神经功能减退状况[7]。已有研究证实，丁苯酞能够改善AD模型动物认知和记忆功能的作用[8]。本研究旨在深入探讨丁苯酞在Aβ诱导新生SD大鼠神经元凋亡的保护机制，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 选择出生24 h内的24只SD乳大鼠，雌雄不限，由本院实验动物中心提供。

1.1.2 试剂 丁苯酞购自石药集团恩必普药业有限公司；DMEM/F12培养基、10%胎牛血清、0.25%胰酶消化液、青链霉素双抗混合液以及谷氨酰胺均购自美国Gibco公司；四甲基偶氮唑（MTT）、脂质体2000等购自美国Invitrogen公司；Caspase 3

测定试剂盒、肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）检测试剂盒（ELISA）购自美国R&D公司；抗iNOS抗体购自美国Sigma公司；ECL化学发光试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1 海马神经元细胞培养 取出生24 h内的SD乳大鼠，消毒后在无菌条件下断头，取出大鼠双侧海马组织放入4 ℃预冷的DMEM/F12培养基中，除去脑膜组织和微血管。DMEM/F12培养基清洗2次，手术剪剪成1 mm×1 mm×1 mm大小的小块，加入等体积0.25%胰酶消化液后轻柔吹打，将上清转移至干净的PE管中，滴加胎牛血清终止消化。余下悬液于37 ℃培养箱内继续消化15 min，滴加胎牛血清终止消化，过200目细胞筛，1000 r/min离心5 min保留沉淀，加入DMEM/F12培养基中制成单细胞悬液，立即接种于含有6孔板细胞培养板内，37 ℃、5% CO2培养箱内培养，去除成纤维细胞，将未贴壁细胞接种至细胞瓶内。次日更换为无血清培养基，以后每3天换液一次。

1.2.2 细胞分组和处理 将培养的大鼠海马神经元细胞分成Aβ组、Aβ+丁苯酞组和对照组三组，每组8只。其中Aβ组采用20 μmol/L Aβ处理24 h；Aβ+丁苯酞组先采用10 μmol/L 丁苯酞处理30 min后再加入20 μmol/L Aβ处理24 h；对照组不进行任何处理。每组独立实验重复3次。

1.2.3 MTT法测定海马神经元存活率 将培养在96孔细胞培养板中的各组大鼠海马神经元分别予以相应干预24 h后，每孔分别加入180 μL培养基和20 μL 5 g/L的MTT，于37 ℃培养箱内孵育4 h后加入100 μL二甲亚砜溶液，继续培养15 min后通过酶标仪测定570 nm处吸光值。每组独立实验重复3次。

1.2.4 海马神经元细胞凋亡测定 各组细胞于6孔细胞培养板培养6 d后给予相应处理干预24 h，采用D-Hank溶液清洗细胞2次，10%甲醛固定40 min，冲洗3次，加入含有HO33342染液的D-Hank溶液染色30 min后在荧光显微镜下计数至少10个不同视野下神经元细胞凋亡率。每组独立实验重复3次。

1.2.5 诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）表达测定 将各组大鼠海马神经元细胞仪5×105/孔浓度接种至6孔培养板内，给予相应处理培养24 h，弃上清，裂解细胞，离心后收集上清，采用BCA法测定上清中蛋白质浓度。各组取等量蛋白，采用Western Blotting法检测各组iNOS表达情况，以β-actin作为内参。iNOS表达量采用各组iNOS蛋白条带与β-actin条带灰度值之比。每组独立实验重复3次。

1.3 统计学处理 采用SPSS 20.0软件对所得数据进行统计分析，计量资料用（x±s）表示，组间比较采用单因素方差分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组海马神经元存活率比较 MTT法检测各组海马神经元存活率结果显示，Aβ组和Aβ+丁苯酞组OD570均显著低于对照组（P<0.05），Aβ+丁苯酞组OD570显著高于Aβ组（P<0.05）。Aβ组和Aβ+丁苯酞组相对于对照组的海马相神经元对存活率分别为48.15%、69.13%。

2.2 各组海马神经元细胞凋亡比较 Aβ组和Aβ+丁苯酞组海马神经元细胞凋亡率分别为（50.38±5.32）%和（25.87±2.66）%，均显著高于对照组的（1.24±0.17）%，而Aβ组海马神经元细胞凋亡率显著高于Aβ+丁苯酞组（P<0.05）。

2.3 各组iNOS表达情况比较 Western Blotting结果显示，Aβ组、Aβ+丁苯酞组和对照组iNOS相对表达量分别为（1.92±0.18）、（0.98±0.12）和（0.37±0.08），Aβ组和Aβ+丁苯酞组iNOS相对表达量均显著高于对照组，Aβ组iNOS相对表达量显著高于Aβ+丁苯酞组（P<0.05）。

3 讨论

据估计，2015-2030年全球AD患者将达到甚至超过10亿人，这对于人类健康是极大的挑战[9-10]。目前医学界普遍认为AD最重要的发病原因是Aβ在神经元细胞外异常沉积，进而引起神经元退行性病变。研究表明，AD的发生和进展与神经元细胞凋亡关系密切，并认为神经元细胞凋亡是AD患者神经元退行性病变和死亡的关键途径[11-12]。因此，有学者提出通过控制神经元细胞凋亡来抑制和治疗AD[13-14]。本研究结果显示，Aβ组大鼠海马神经元细胞存活率显著低于对照组，细胞凋亡率和iNOS相对表达量均显著高于对照组；在Aβ处理前采用丁苯酞进行处理30 min，能够有效提高细胞存活率，降低细胞凋亡率和iNOS相对表达量，表明丁苯酞对于大鼠海马神经元细胞具有一定的保护作用。iNOS是一种诱导酶，正常条件下表达量极低，在病理条件或者受到严重威胁时发生高表达，iNOS半衰期较长，也就意味着iNOS一旦表达则可在较长时间内发挥其活性作用，大量、持续性产生一氧化氮（NO），进而介导一系列细胞毒性作用[15-16]。

研究表明，丁苯酞具有良好的抗脑缺血、血栓形成以及血小板聚集作用，能够有效改善线粒体功能，清除氧自由基，并可以改善脑缺血区域微循环和血流动力学[17-18]。丁苯酞目前被广泛应用于痴呆、缺血性脑病等治疗。张丽娜等[19]应用丁苯酞治疗急性缺血性脑卒中患者，结果表明丁苯酞能够明显改善患者认知功能。王伟等[20]建立缺血再灌注脑损伤大鼠模型，研究丁苯酞对模型大鼠海马神经元的保护作用，结果表明不同剂量丁苯酞均能降低大鼠脑梗死体积，减少海马组织5-羟色胺阳性细胞数量，提示丁苯酞可能通过降低5-羟色胺的表达实现对海马神经元的保护作用。

综上，丁苯酞能够有效抑制Aβ造成的大鼠海马神经元细胞的凋亡作用，降低iNOS表达水平，减少自由基产生和毒性作用。

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（收稿日期：2017-03-27） （本文编辑：程旭然）