HPLC法同时测定有柄石韦中6种有效成分的含量

邵尉，高德民

(山东中医药大学药学院，山东 济南250355)



【中药与天然活性产物】

HPLC法同时测定有柄石韦中6种有效成分的含量

邵尉，高德民*

(山东中医药大学药学院，山东 济南250355)

建立了高效液相色谱法同时测定有柄石韦中原儿茶酸、绿原酸、香草酸、咖啡酸、芒果苷以及芦丁6个主要成分含量的方法。采用SinoChrom ODS-BP C18(4.6 mm × 150 mm，5 μm)色谱柱，以质量分数0.1%磷酸(A)-乙腈(B)为流动相进行梯度洗脱，流速1.0 mL/min，检测波长320 nm，柱温25 ℃。结果表明，6种成分线性关系良好(R≥0.999 2，n=5)，且分离度较好，平均加样回收率相对标准偏差均小于5%。该方法快速、简便、准确，为药用植物有柄石韦的定量检测和质量控制提供了实验依据。

有柄石韦；高效液相色谱法；成分；测定

有柄石韦(Pyrrosiapetiolosa(Christ) Ching)是中药石韦的基源植物之一，为水龙骨科(Polypodiaceae)石韦属(PyrrosiaMirbel)植物，其味甘、苦，性微寒，具有利尿通淋，清肺止咳，凉血止血等功效[1]，临床上主要用于热淋、血淋、石淋、小便不通、热喘咳、尿血等症[2]。现代研究表明，有柄石韦中含有多酚、皂苷、多糖、挥发油等多种化学成分[3-5]。其中多酚是中药石韦的主要活性成分，具有抗氧化、抗菌、抗癌等多种临床药用功效，对人类健康有着重要的作用[6-7]。在以往对中药石韦的研究中，研究者大多数通过HPLC法测定指标性成分分析中药石韦的质量，而指标性成分大多只选择绿原酸[8]。本文利用HPLC法对有柄石韦醇提取物中的原儿茶酸、绿原酸、香草酸、咖啡酸、芒果苷以及芦丁6种化学成分进行了含量测定，从而为有柄石韦的质量控制以及后期更深入的开发研究提供有效的数据支持。

1 仪器与试药

1.1 仪器

LC-10AT高相液相色谱仪(日本岛津公司)；N2000色谱工作站(浙大智达自动化信息工程有限公司)；PS-40A超声波清洗器(深圳超艺达科技有限公司)；HZT-A100电子天平(福建华志科学仪器有限公司)；DS-T300高速多功能打粉机(上海顶帅工贸有限公司)。

1.2 试药

原儿茶酸(成都普菲德生物技术有限公司，批号：151123)；绿原酸(成都曼思特生物科技有限公司，批号：MUST-15041814)；香草酸(成都普菲德生物技术有限公司，批号：151116)；咖啡酸(成都普菲德生物技术有限公司，批号：151103)；芒果苷(成都曼思特生物科技有限公司，批号：MUST-16040103)；芦丁(成都曼思特生物科技有限公司，批号：MUST-15091104)；以上标准品纯度均大于98%。乙腈(美国天地公司)为色谱纯；水(娃哈哈纯净水)；其余试剂均为分析纯(天津市富宇精细化工有限公司)。

所用药材经山东中医药大学高德民副教授鉴定为水龙骨科石韦属植物有柄石韦，植物标本保存于山东中医药大学标本馆(标本号：样品1 2014102701、样品2 2014052712、样品3 2014091202)，样品信息见表 1。

表1 样品信息

2 方法与结果

2.1 色谱条件

采用SinoChrom ODS-BP C18(4.6 mm × 150 mm，5 μm)色谱柱；以质量分数0.1%的磷酸(A)-乙腈(B)为流动相进行梯度洗脱,梯度洗脱程序见表2；体积流量1.0 mL/min；进样量20 μL，检测波长320 nm；柱温25 ℃。

表2 流动相A(0.1%磷酸)和B(乙腈)的线性梯度

2.2 对照品溶液的制备

精密称取原儿茶酸、绿原酸、香草酸、咖啡酸、芒果苷以及芦丁标准品适量，分别置于5 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度线，摇匀，制成相应的对照品溶液。各自取适量，混合，最终制成含原儿茶酸0.166 7 mg/mL、绿原酸0.024 6 mg/mL、香草酸0.017 1 mg/mL、咖啡酸0.029 6 mg/mL、芒果苷0.025 6 mg/mL、芦丁0.057 4 mg/mL的混合对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备

将干燥的有柄石韦药材粉碎，过40目筛，用石油醚浸泡过夜，晾干备用。精密称取脱脂后的粉末5 g，置于具塞锥形瓶中，准确加入50 mL 70%甲醇，称定重量，超声处理50 min，放冷，再次称定重量，70%甲醇补足减少的重量，摇匀，静置。取上清液，0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，得供试品。

2.4 方法学考察

2.4.1 线性关系

取2.2项下混合对照品溶液，加甲醇稀释成5个不同质量浓度的对照品溶液，在2.1项色谱条件下进样分析，以对照品含有量为横坐标(X)，以色谱峰面积为纵坐标(Y)绘制标准曲线，结果见表 3，表明各成分在各自线性范围内线性关系良好。

表3 6种成分的线性关系

2.4.2 精密度实验

取2.2项下的混合对照品溶液重复进样6次，每次进样20 μL，测定各个对照品的峰面积，结果显示原儿茶酸、绿原酸、香草酸、咖啡酸、芒果苷以及芦丁峰面积的相对标准偏差分别为1.04%、0.92%、1.02%、0.93%、0.89%、1.15%，表明仪器精密度良好。

2.4.3 重复性实验

取1号样品6份，按照2.3项步骤制备6份供试液，依法测定。最终测得原儿茶酸、绿原酸、香草酸、咖啡酸、芒果苷以及芦丁峰面积的相对标准偏差分别为1.98%、2.03%、1.02%、1.82%、0.92%、2.03%，结果表明仪器重复性较好。

2.4.4 稳定性实验

取混合对照品溶液1 d内每隔4 h进一次样，最终测得原儿茶酸、绿原酸、香草酸、咖啡酸、芒果苷以及芦丁峰面积的相对标准偏差分别为0.75%、1.04%、1.03%、1.12%、0.94%、1.06%，结果表明该方法具有良好的稳定性。

2.4.5 加样回收率实验

精密称取1号样品3份，按照2.3项制得供试液，精密加入原儿茶酸、绿原酸、香草酸、咖啡酸、芒果苷以及芦丁标准品适量，加甲醇定容至20 mL。在2.1项色谱条件下测定，计算加样回收率，结果见表4。

表4 6种成分的加样回收实验结果(n=3)

2.5 样品测定

将混合对照品和供试品按照上述色谱条件进行HPLC法测定，见图1。利用线性回归方程计算3个不同产地样品中6种指标成分的含量，结果见表5。

A 对照品;B 有柄石韦(陕西);C 有柄石韦(浙江);D 有柄石韦(河北)。图1 HPLC色谱图Fig.1 The chromatogram of HPLC

采集地点原儿茶酸绿原酸香草酸咖啡酸芒果苷芦丁陕西汉中1．9165．0202．1160．1980．1920．707浙江温州1．2069．0552．9290．6880．7691．593河北承德0．8623．3640．8470．1830．2140．467

3 讨 论

本实验实现了HPLC法同时对有柄石韦中原儿茶酸、绿原酸、香草酸、咖啡酸、芒果苷以及芦丁6种化学成分含量的测定，同时又对3个不同产地的有柄石韦进行了HPLC 法测定。实验结果表明，这3个不同产地的有柄石韦均符合《中国药典》(2015版)[1]的标准(绿原酸质量分数≥0.2%)。其中样品3(河北)中的6种化学成分含量均较另外两个产地的含量低。样品2(浙江)的绿原酸含量最高，每1 mg生药中含绿原酸为9.055 μg(绿原酸质量分数为0.905%)，并且，样品2(浙江)中除原儿茶酸的含量低于样品1(陕西)之外，其余5种化学成分含量均高于另外两个产地样品的含量。据此推测样品2(浙江)的活性可能较另外两个产地的样品更好。

关于中药石韦，《中国药典》(2015版)只对绿原酸的含量做了具体要求，本实验发现有柄石韦中原儿茶酸、香草酸和芦丁的含量也较高。近期研究发现，原儿茶酸不仅有降低心肌耗氧量、减慢心率等药理作用，而且还有较好的体外抗氧化活性[9]；香草酸有较好的抗菌作用，体外显示还有抗炎活性[10]；芦丁可以降低毛细血管通透性和脆性，同时又具有抗炎，抗病毒、抗氧化等方面的作用[11]。目前对有柄石韦的研究指标性成分大多只选择绿原酸，而随着对中药质量控制要求的日益严格，作者认为多成分同时测定是必然趋势。本实验选择原儿茶酸、绿原酸、香草酸、咖啡酸、芒果苷以及芦丁6种化学成分作为指标性成分进行了研究，为药用植物有柄石韦的定量检测和质量控制提供了实验依据。

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典2015年版一部[M]. 北京：中国医药科技出版社，2015：90.

[2]陈露，刘布鸣，马军花，等. 中药石韦的研究概况[J]. 广西医学，2011，33(11)：1486-1489.

[3]陈军华，周光明，彭贵龙，等. HPLC同时测定石韦中绿原酸、槲皮素和山柰酚含量[J]. 中国中医药信息杂志，2014，21(8)：67-69.

[4]王自军，杨红兵，齐誉，等. 正交设计研究石韦总黄酮和鞣质提取工艺[J]. 时珍国医国药，2007，18(2)：463-464.

[5]韦志疆. RP-HPLC法测定光石韦中芒果苷的含量[J].中国医药导报，2012，9(10)：137-138.

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[8]黄海婷，钟霞军，顾敬文，等. 广西不同产地石韦药材绿原酸含量的测定[J]. 南方农业学报，2014， 45(3)：475-478.

[9]李取胜，王伟，韩秋俊，等. 原儿茶酸衍生物的合成及活性研究[J]. 中国中药杂志，2013，38(2)：208-211.

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Simultaneous determination of six active constituents in thePyrrosiapetiolosa(Christ) Ching by HPLC

SHAO Wei, GAO De-min*

(Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250355, China)

∶A HPLC method for simultaneous determination of the contents of six main bioactive constituents (protocatechuic acid, chlorogenic acid, vanillic acid, caffeic acid, mangiferin, and rutin) in thePyrrosiapetiolosa(Christ) Ching was presented. The analysis was performed on SinoChrom ODS-BP C18(4.6 mm × 150 mm，5 μm)column. The six components were separated with gradient elution using mobile phase composed of 0.1% acetic acid (A)-acetonitrile (B) at a flow rate of 1.0 mL/min. The UV detection wavelength was set at 320 nm. The column temperature was kept at 25℃. Six ingredients showed good linear relationship (R≥0.999 2,n=5), with relative standard deviation values less than 5%. Results reveal that this method is rapid, simple, and accurate, to provide experimental foundation for the quantitative detection and quality control of MedicalPyrrosiapetiolosa(Christ) Ching.

∶Pyrrosiapetiolosa(Christ) Ching; HPLC; ingredient; determination

10.3976/j.issn.1002-4026.2017.03.005

2016-11-28

邵尉(1992—)，女，硕士研究生，研究方向为中药资源与质量控制。

*通信作者，高德民。E-mail:gdm607@126.com

R284.1

A

1002-4026(2017)03-0021-05