荧光法测定叶绿素a的影响因素及其数据校正

张丽，郭翠莲，张述伟，吴宁，王小红，张天鹏，王昭玉

(山东省科学院海洋仪器仪表研究所，山东 青岛 266001)



【海洋科技与装备】

荧光法测定叶绿素a的影响因素及其数据校正

张丽，郭翠莲，张述伟，吴宁，王小红，张天鹏，王昭玉

(山东省科学院海洋仪器仪表研究所，山东 青岛 266001)

研究了浊度、温度对叶绿素a现场荧光仪测定叶绿素a的影响。分别用可见光分光光度计和叶绿素a现场荧光仪测定了不同温度、浊度梯度下小球藻水样的叶绿素a浓度值，探究影响规律和修正方法。结果表明，温度在7 ～ 30 ℃范围内，对叶绿素现场荧光仪测定叶绿素a浓度无显著影响；浊度在0 ～ 1 000 度范围内，需用叶绿素a浓度实测值减去0.0174倍的浊度值(度)对测定值进行修正。

浊度；温度；叶绿素a；荧光法

海洋中叶绿素a浓度及其时间变化可以反映水体中浮游植物的丰度及其变化规律，在一定程度上反映了水体中藻类数量和水质状况，在研究浮游植物群落生物量、海洋生态环境特点、水生生态系统监测等方面起着重要的作用[1]，是水质环境监测的常规监测项目之一。

目前叶绿素a的测定方法有荧光法[2]、分光光度法[3]、高效液相色谱法[4]、遥感法等，其中荧光法因具有灵敏度高、简单易操作、可现场实时测定等特点，已成为测定水体中叶绿素a的主要方法。应用荧光法基于叶绿素a的荧光诱导原理,研发叶绿素a现场荧光仪已成为国内外海洋监测研究的热点之一[5-9]。叶绿素荧光仪具有小型化、携带方便、低功耗、集成化等优势[10]，具有较好的应用前景。然而叶绿素a现场荧光仪检测的环境是实际水体，自然水体环境较复杂，测量结果不可避免地会受到环境因素的影响，其中温度和浊度是最主要的影响因素。

本文通过实验分析温度和浊度对现场荧光法测定叶绿素a的影响规律，确定了影响范围，从而对现场测定的数值进行修正，使实验数据更具可靠性，为叶绿素a现场荧光法测定的应用提供了参考依据。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

YSI 6600型多参数水质监测系统(美国YSI公司)；可见光分光光度计(尤尼柯(上海)仪器有限公司)。无浊度海水：取自石老人海水浴场，通过0.45 μm滤膜制备；无藻悬浊液由海水沉积物制备，海水沉积物采自山东青岛潮连岛外海；丙酮为国产分析纯；试验用海水小球藻由国家海洋局第一海洋研究所提供。

1.2 实验方法

1.2.1 无藻悬浊液的制备及浊度的测定

参照张武等[11]的研究结果，叶绿素在高温下能够降解，将采集的沉积物湿样于坩埚中105 ℃灼烧60 min[3],灼烧后的沉积物经过研磨、过150目孔筛，按照0 ～ 1 000 度浊度梯度加入到过滤海水中，搅拌均匀制成无藻悬浊液。浊度采用YSI 6600型多参数水质监测系统测定。

1.2 样品叶绿素a的测定

1.2.1 分光光度法

将不同浓度叶绿素含量的藻液悬浊液以丙酮溶液(体积分数90% )提取浮游植物色素后，依次在630、647、664、750 nm波长下测定吸光度，并以90%丙酮作为校正空白，测定叶绿素a的含量[12]。计算公式为:

式中：ρa为样品中叶绿素a的质量浓度，μg/L；v为样品提取液体积，mL；V为样品实际用量，L；L为测定池光程，cm。

1.2.2 YSI 6600型多参数水质监测系统

检查仪器连接，连好后开机，并打开软件。将YSI叶绿素传感器探头置于不同浓度叶绿素含量的藻液悬浊液样品中，待示数稳定后读取测量结果。

1.3 浊度对叶绿素a现场荧光仪测定结果的影响

取不同体积的海洋小球藻母液，用过滤海水定容至一定体积，将叶绿素a现场荧光仪置于样品中，按照一定浓度梯度(0 ～ 1 000度)加入沉积物样品，用磁力搅拌器搅拌均匀，待叶绿素a现场荧光仪的示数稳定，连续读数2 min，同时测定其浊度，取平均值。分别测试分析浊度对2.1、11.70、20.2 μg/L叶绿素a浓度的海水小球藻悬浊液的影响。

1.4 温度对叶绿素a现场荧光仪测定的影响

以叶绿素a浓度为 3.5 μg/L的小球藻悬浮液作为测试样品，将样品和YSI 6600型多参数水质监测系统同时冰浴、水浴，根据实际水体的温度变化范围，使温度变化在7 ～ 30 ℃之间，记录温度和叶绿素a测定值，分析温度对叶绿素a现场荧光法测定结果的影响。

2 结果与讨论

2.1 浊度对叶绿素a现场荧光仪测定结果的影响

在不同浊度的影响下，叶绿素a测定结果见图1。

图1 浊度对测定不同叶绿素a浓度小球藻样品的影响曲线Fig.1 The influence of turbidity on determination of different chlorophyll a concentration of Chlorella vulgaris

由图1可知，浊度在0 ～ 1 000 度范围内，相同浓度的叶绿素a样品随着浊度的升高测定值呈上升趋势，且叶绿素值和浊度呈显著的正相关(p<0.05)。两者符合线性回归方程 y = kx。其中x为样品的浊度；y为浊度影响下叶绿素a测量值；k为线性斜率。实验设置3个叶绿素浓度(2.1、11.70、20.2μg/L)的小球藻底值，结果表明受浊度影响的程度均一致，k分别为 0.017 3、0.017 6、0.017 2，线性相关系数r为 0.988～0.996。以均值0.017 4为系数估算叶绿素a改变量，修正后的值与原测值的相对误差在0.3% ～ 12%之间，远小于未修正的叶绿素a测定值与真值的相对误差4% ～ 758%。

所以，使用叶绿素a现场荧光仪测定叶绿素值时，当水体浊度在0 ～ 1 000 度范围内，可以用以下公式修正测定值：

水体中叶绿素a浓度估值(μg/L) = 叶绿素a浓度实测值 - 0.017 4×水体浊度 。

以10%的相对误差为限，当水体浊度(度) / 叶绿素a浓度实测值小于等于5.2时，叶绿素a现场荧光仪测定值与估值之间的偏差较小，即此时浊度对叶绿素a测定结果无显著影响，可以不作修正；当水体浊度(度) / 叶绿素a浓度实测值比值大于5.2时，浊度对测定结果有显著的影响，需要通过上述公式修正后，数据方能接近估值。

实验结果与赵洋甬等[3]、吕鹏翼等[13]在研究浊度对荧光法测定叶绿素a的影响时得出的结论基本一致，即浊度能够引起水体中叶绿素a含量测定值的增加，且增加量与浊度呈正相关。这是由于水体中含有大量悬浮物或颗粒物，会对激发光和产生的荧光发生强烈的反射和散射作用，提高了测定的本底值，从而造成测定结果偏高。对比本实验与前者实验结果表明，叶绿素a现场荧光仪测定值受浊度的影响程度有所不同，主要可能是不同实验仪器性能不同，仪器实验时受环境因素影响不同造成的。

2.2 温度对叶绿素a现场荧光仪测定结果的影响

温度对叶绿素a现场荧光仪影响的测定结果原始数据见表1，处理数据并用Origin9.0作图，见图2。

表1 不同温度下叶绿素a测定值

图2 叶绿素a浓度测定值与温度关系曲线Fig.2 The curve of the measured value of chlorophyll a with temperature

图2是按照1.4中实验步骤得出的结果,由图可以看出,在7 ～ 30 ℃温度范围内，海水叶绿素现场荧光仪测定的叶绿素a浓度值与温度无显著的线性关系。样品叶绿素a浓度值为3.5μg/L，通过数据分析得出在7 ～ 30 ℃温度范围内，测定值与真值的相对误差在-8.6%～11.4%之间，在仪器测量误差的可接受范围内。

一般情况下，溶液的荧光强度随着温度的降低而增强，在一定范围内，荧光强度的减弱与温度的升高呈线性关系。主要是因为温度升高会使溶液的粘度降低，荧光分子和其他分子之间的碰撞几率会增加，造成了荧光猝灭，导致荧光光强度降低[10]。刘建华[10]在研究海水叶绿素现场检测仪温度实验时发现叶绿素a(92.32μg/L)的荧光强度随温度(13 ～ 36 ℃)升高而下降，而本实验未发现此规律，可能是因为本实验使用的海水叶绿素现场荧光仪已对测定值进行校正。

3 结论

在7 ～ 30 ℃范围内，海水叶绿素现场荧光仪测定的叶绿素a浓度值与温度无显著的线性关系。在试验所设浊度范围内(0～1 000度)，使用海水叶绿素a现场荧光仪测定叶绿素a浓度(2.1、11.70、20.2L)时，叶绿素a测定值与浊度呈显著的正相关；当(水体浊度(度)/叶绿素a浓度)实测值不高于5.2时，浊度对叶绿素a测定结果无显著的影响；当(水体浊度(度)/叶绿素a浓度)实测值大于5.2时，浊度对叶绿素a测定结果有显著的影响，可用(叶绿素a浓度测定值-0.017 4×水体浊度(度))进行修正，得到与水体中实际叶绿素a浓度较为接近的估计值。

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The influence factors of fluorescence determination of chlorophyll a and the data correction for them

ZHANG Li,GUO Cui-lian, ZHANG Shu-wei, WU Ning, WANG Xiao-hong, ZHANG Tian-peng, WANG Zhao-yu

(Institute of Oceanographic Instrumentation, Shandong Academy of Sciences, Qingdao 266001, China)

∶ The impacts of turbidity and temperature on the determination of chlorophyll a in the sea water with field fluorescence method were studied in this paper. The chlorophyll a concentration ofChlorellavulgarisat different temperature and turbidity gradients was determined by visible spectrophotometer and the field fluorescence respectively, to explore the influence rule and the method for correction. Results reveal that temperature has no significant effects on the concentration of chlorophyll a in the range of 7 ～ 30 ℃, while turbidity has significant influence on the determination of chlorophyll a in the range of 0 ～ 1 000 NTU, which should be modified by the following method: The true value equals to measured value minus 0.017 4 times’ turbidity value (NTU).

∶turbidity; temperature; chlorophyll a; fluorescence

10.3976/j.issn.1002-4026.2017.03.002

2016-11-22

海洋公益性行业科研专项经费项目(201505007)；山东省科学院青年基金(2014QN039)；山东省优秀中青年科学家科研奖励基金(BS2014HZ015)

张丽(1988—)，女，研究实习员，研究方向为海洋环境监测。E-mail: zhang1222li@163.com

P714

A

1002-4026(2017)03-0008-04