Promicol ATP微生物快速检测系统在UHT灭菌奶商业无菌检测上的应用研究

文/林木娣 黄诗韵 杨爱君 何 瑛

Promicol ATP微生物快速检测系统在UHT灭菌奶商业无菌检测上的应用研究

文/林木娣1黄诗韵2杨爱君1何 瑛1

（1 广东燕塘乳业股份有限公司；2 广州中实生物科技有限公司）

介绍一种微生物快速检测系统，利用活体微生物中的三磷酸腺苷（ATP）作为标记分子，通过检测超高温（UHT）灭菌奶中微生物的ATP在反应过程中产生的荧光强度，可以间接测定样品中的微生物含量。该方法具有简便、快速、灵敏度高的优点，经验证能与国标法商业无菌检测达到一样的筛查检验目的，能够对UHT产品进行快速放行，在UHT灭菌乳与乳制品的质量监控中具有重要的意义。

三磷酸腺苷（ATP）；商业无菌检测；超高温（UHT）灭菌奶；快速检测

乳与乳制品是大家公认的营养全面的食品，对改善居民的营养、平衡膳食结构、补钙和增强体质均有重要的作用。超高温（UHT）灭菌奶是其中的一种，因其保存方便、保质期长的特点，受到广大消费者的喜爱。按照国家安全标准的要求，所有经过UHT灭菌的食品都需要经过商业无菌检验合格才能出售，因商业无菌的微生物检验[1]需耗时10 天以上，检验周期长给企业的仓储、资金回笼等带来较大的压力，越来越多的企业迫切需要一种可靠的、稳定的、快速的微生物检测方法来替代传统的商业无菌检验方法，从而达到快速筛查放行的目的，为抢占市场及内部经营提供便利。

三磷酸腺苷（Adenosine triphosphate，ATP）生物发光检测方法具有简便、快速、灵敏度高的优点，已广泛应用在微生物检测[2]、食品卫生监控[3]等领域，而欧洲、澳洲等地近年也致力于ATP微生物快速检测系统在UHT灭菌奶的商业无菌检验的研究及推广。

1 Promicol ATP微生物快速检测系统

Promicol ATP微生物快速检测系统是利用ATP生物发光原理对产品中的微生物进行检测。本文从检验的原理、方法、操作便利性、检测所需时间、方法可靠性及稳定性等方面进行研究和评估。

1.1 ATP生物发光检测的原理

ATP生物发光检测的原理[4]基于以下两点。

（1）ATP作为活体微生物的标记分子，存在于所有活细胞中，可以作为能量的直接提供者，而对于在一定生理时期内的活体微生物，ATP浓度与活体微生物含量之间有良好的线性关系。

（2）在自然界中，ATP可诱导生物发光系统发光，一个常见例子为萤火虫尾部的荧光素/荧光素酶反应，反应机制如下：

通过检测ATP在反应过程中产生的荧光强度，可以间接测定样品中的微生物含量。

1.2 ATP微生物快速检测系统检验方法

试验使用Promilite M4仪器（荷兰Promicol）及UHT/ESL牛奶检测试剂（荷兰Promicol，货号：399-4041201），Photonix®控制软件分析。

产品经过48 h整包保温后，取适量样品置于ATP微生物检测系统内，系统首先会使用Proase试剂（ATP双磷酸酶）自动去除样品中的非微生物ATP。然后微生物被Promex裂解剂裂解，其中的ATP被释放，当加入Prolux试剂（含荧光素/荧光素酶）后，仪器对样品中的发光量进行检测，发光量换算为相对光子值（Relative Light Units，RLU）。无污染的样品获得低RLU结果，而污染样品的RLU值则比干净样品高出3 倍或以上。

2 ATP微生物快速检测系统验证

验证包括空白值的确认、目标菌（蜡样芽饱杆菌）污染试验及生产过程中受到微生物污染而出现坏包的样品试验，基本覆盖了UHT灭菌奶生产过程中可能出现的微生物污染情况。

2.1 样品ATP空白值确认

空白值即阴性（或无菌）样品的RLU值。为了能够灵敏地检测出污染样品中低水平微生物的ATP，选用的试剂需要有效地去除UHT灭菌奶样品中可能存在的非微生物ATP（体细胞ATP或游离ATP），得到尽可能低并可重复获得的空白值。

确定空白值后，判定各种样品合格与否的具体标准如下。

（1）若样品RLU值低于2 倍空白值，则该样品为阴性。

（2）若样品RLU值在2～3倍空白值，则结果视为可疑，该样品应继续保温6 h后重新检测，若样品为阳性样，RLU值会大幅度上升。

（3）若样品RLU值大于3 倍空白值，则该样品为阳性。

从每种UHT灭菌奶中选取10 盒阴性样品（最好来自不同批次）进行保温。保温后每盒样品均取4 个样品进行重复性检测，取所有阴性结果平均值作为空白值。如有异常样品，需排除此样品的检测结果。具体操作如下：

将10 盒样品放置于36 ℃保温48 h，摇匀经过保温的样品后，用酒精消毒包装，并从每个样品中分别吸取4×50 μL到微孔板（无ATP）的4 个孔中，Promilite M4仪器自动完成整个“UHT/ESL样品”程序，检测结果以RLU表示。

在进行Promicol ATP系统检测的同时，取1 mL样品倾注平板，平板于36 ℃培养48 h。平板计数结果为阴性的样品可以采用，结果为阳性的样品需被排除。

本试验测试了UHT灭菌纯牛奶、UHT灭菌高钙奶、UHT灭菌甜牛奶及UHT灭菌红枣奶产品的空白值，并在控制软件Photonix®中分别设置了上述产品合格与否的判定限值。

2.2 蜡样芽孢杆菌人工污染试验

为了验证Promicol ATP 系统能否足够灵敏地检测出UHT灭菌奶中低浓度的微生物污染，在纯牛奶中人为加入蜡样芽孢杆菌（革兰氏阳性代表菌，有芽孢）进行试验。

试验前先使用LB液体培养基过夜复苏蜡样芽孢杆菌，然后使用无菌生理盐水对菌株进行10 倍梯度稀释（图1）。分别将1 mL的10-5、10-6、10-7和10-8稀释度的菌液倾注平板，平板于36 ℃培养48 h后进行菌落计数，确定稀释菌液的初始浓度；同时接种1 mL该稀释度菌液到样品中，每个浓度的菌液稀释液接种2 个样品，样品封口并置于36 ℃中保温孵育48 h。保温孵育后，对样品进行ATP检测。

在无菌条件下，从每个接种菌液的样品中吸出4×50 μL置于4 个微孔中，放入Promilite M4后，仪器自动完成“UHT/ESL样品”检测程序（图2）。在Photonix®软件中，根据之前获得的空白值，检测结果自动解析成“合格”“可疑”及“不合格”。

Promicol ATP系统检测后，将1 mL 样品倾注平板，平板于36 ℃培养48 h。平板结果记录为“生长（G）”或“没生长（NG）”。

2.3 自然阳性样品分离菌株人工污染试验

在生产过程中收集到的一个自然阳性样品（坏包），用无菌取样环取样划线，分离并获得污染微生物的单个菌株后，按2.2的操作，人工污染合格批次的UHT纯牛奶样品，并进行Promicol ATP系统检测和平板法检测的对比验证。

图1 对过夜复苏的菌株进行10 倍梯度稀释

图2 检测流程示意图

2.4 Promicol ATP系统检测与GB 4789.26-2013商业无菌对照试验

抽取UHT灭菌奶产品10 盒，36 ℃保温48 h进行Promicol ATP系统检测；另取相同时间段产品10 盒按照GB 4789.26-2013《食品安全国家标准 食品微生物学检验 商业无菌检验》的要求进行检验。

3 结果分析

3.1 样品的ATP空白值

选取3 个批次共10 个样品的UHT灭菌纯牛奶进行试验。经过36 ℃保温48 h后，阴性样品的空白ATP值检测结果见表1。

从表1可知，使用本次选用的试剂盒检测纯牛奶样品，在36 ℃保温48 h的条件下，均能获得低的且可重复的空白值。同时，所有样品对应的平板检测结果均为阴性，说明所选取的样品ATP检测结果均可采用。

根据同样操作，对UHT灭菌高钙奶、UHT灭菌甜牛奶及UHT灭菌红枣奶产品进行空白值确认，在空白值平均值的基础上，可以确定各种产品ATP检测的“合格”“可疑”和“不合格”限值（表2）。

表1 36 ℃保温48 h后阴性UHT灭菌纯牛奶的ATP空白值

表2 UHT灭菌奶的“合格”“可疑”和“不合格”限值

3.2 蜡样芽孢杆菌人工污染试验结果

选取合格批次的UHT灭菌纯牛奶样品进行试验。根据2.2的操作，在样品中接种不同浓度的蜡样芽孢杆菌。人工污染的样品代表实际过程中的不合格产品，对菌液稀释液进行平板检测是为了确认接种液的真实浓度（CFU/mL）。每个样品接种1 mL菌液稀释液，每个稀释度进行2 个样品重复。进行Promicol ATP检测时，每个样品检测4 个重复，同时每个样品均取1 mL做平板法对照，结果记录为“生长（G）”或“没生长（NG）”。检验结果如表3所示。

从表3结果可知，接种了不同浓度的蜡样芽孢杆菌的纯牛奶样品，经过36 ℃保温48 h后，ATP检测能获得高RLU值。其中，接种了10-7稀释度菌液的样品说明，即使样品中的初始污染菌量为1 CFU/ mL，经过保温后，Promicol ATP系统仍然能检测出样品阳性，表明Promicol ATP系统具有很高的灵敏度。10-8稀释度初始接种菌液平板获得结果为0 CFU/mL，而接种样品保温后检测结果显示一个为阳性、一个为阴性，表明在菌液原始浓度很低时，一个样品接种到菌株，而另一个样品并没有接种到菌株。这两个样品保温后分别取1 mL用平板复检，结果也对应为一个阳性、一个阴性，ATP检测结果与传统平板法结果一致。

3.3 自然阳性样品分离菌株人工污染试验结果

在样品中接种不同浓度的自然阳性分离菌，模拟实际过程中受污染的产品。每个样品接种1 mL菌液稀释液，每个稀释度进行2 个样品重复。进行ATP检测时，每个样品检测4 个重复。Promicol ATP方法检测的同时，每个样品均取1 mL用平板法检验，结果记录为“生长（G）”或“没生长（NG）”。检验结果如表4。

从表4结果可知，接种了不同浓度的自然阳性分离菌的纯牛奶样品，经过36 ℃保温48 h后进行ATP检测，能获得高RLU值。其中，接种了10-6稀释度菌液的两个样品说明，即使样品中的初始菌污染水平很低（＜10 CFU/mL），经过保温后，Promicol ATP系统仍然能检测出样品阳性，表明Promicol ATP系统具有很高的灵敏度。10-7稀释度初始接种菌液平板获得结果为0 CFU/mL，而接种样品保温后，两种方法的检测结果均为一个阳性、一个阴性，表明在菌液原始浓度很低时，一个样品接种了低浓度菌株，而一个样品并没有接种到菌株。此试验结果表明，ATP检测结果与传统平板法结果一致。

表3 36 ℃保温48 h后，人工污染的纯牛奶的ATP检测值

表4 36 ℃保温48 h后，人工污染自然阳性分离菌的UHT灭菌纯牛奶的ATP检测值

3.4 Promicol ATP系统检测与GB 4789.26-2013商业无菌对照试验结果

抽取UHT灭菌高钙奶10 盒，36℃保温48 h进行ATP检测，另抽取同批次相同时间段的产品10 盒，按照GB 4789.26-2013《食品安全国家标准 食品微生物学检验 商业无菌检验》的要求操作，记录感官、pH值及微生物变化，检测结果如表5。

从表5结果可知，国标法检验样品感官正常，pH值与对照样差异为0.06，无微生物增殖，符合商业无菌要求；采用Promicol ATP系统检验结果为合格，与国标商业无菌检验结果相符。

4 应用情况

当前实验室UHT灭菌奶产品采取36 ℃保温48 h检验菌落总数与36℃保温7 天测pH值相结合，并辅以部分商业无菌检验的模式，在以上验证试验获得预期结果的情况下，部分产品进行Promicol ATP系统快速放行，同时与当前检验模式对照，结果如表6。

由表6可见，Promicol ATP系统检验结果与传统检验方法的结果一致，可以替代传统检验方法用于UHT灭菌奶的快速放行。

5 结论

5.1 通过试验验证，使用Promicol ATP系统进行UHT灭菌奶商业无菌快速检测，所选的试剂及程序能有效去除样品中的非微生物ATP，并获得低且可重复的阴性空白RLU值。

5.2 蜡样芽孢杆菌人工污染试验及自然阳性样品分离菌株人工污染试验结果均表明，Promicol ATP检测方法灵敏度高，且检测结果与平板法检测结果一致，能检测出日常生产中有可能污染产品的微生物。

5.3 与国标法商业无菌检验对照试验结果及后续使用情况表明，Promicol ATP系统检验结果与GB 4789.26-2013《食品安全国家标准食品微生物学检验 商业无菌检验》相符。

5.4 验证过程可知，使用Promicol ATP系统对UHT灭菌奶进行检测，约25 min可完成96 个样品的检测，且操作简便，此方法可作为快速、便利的商业无菌检验方法。

6 展望

根据灭菌乳相关国家标准规定，UHT灭菌奶放行的微生物要求需要符合商业无菌标准，执行GB 4789.26-2013《食品安全国家标准 食品微生物学检验 商业无菌检验》，该方法操作相对繁琐，且需要对产品进行10 天的保温再进行检测。目前，乳品企业大多采用保温5～7 天后，平板培养2 天的方法对产品进行等同于商业无菌的检测。所以，越来越多的乳品企业倾向选择可靠、稳定的微生物快速检测方法，作为产品快速放行的快筛手段。

表5 UHT灭菌高钙奶ATP系统检测值与国标法检验结果对照

表6 ATP系统检测值与当前实验室检验对照

采用Promicol ATP微生物快速检测系统，乳品企业对产出样品进行36 ℃保温48 h后快速检测，能在2.5～3 天内实现产品放行，且结果准确、灵敏度高、操作简便，大大提高工作效率，缩短UHT灭菌奶的检验时间，加强企业的市场竞争力，加速企业资金回流，对乳品企业质量控制的发展具有重要意义，在其它UHT产品（如饮料）上也有广阔的应用前景。

[1] 中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会. GB 4789.26-2013食品微生物学检验，商业无菌检验[S]. 北京：中国标准出版社，2013.

[2] 尹子波，侯玉柱，尹建军，等. ATP生物发光技术在微生物检测中的应用[J]. 食品研究与开发，2012，33（2）：228-232.

[3] 王茁. ATP 荧光微生物检测法在食品卫生监控领域中的应用与展望[J]. 中国食品卫生杂志，2004，16（3）：266-267.

[4] Luning P A，Devlieghere F，Verhe R. Safety in the agri-food chain[M].The Netherlands：Wageningen Academic Publishers，2006.

The Application of Promicol ATP Microbial Rapid Detection System in UHT Milk Commercial Sterility Test

LIN Mu-di1，HUANG Shi-yun2，YANG Ai-jun1，HE Ying1
（1 Guangdong Yantang Dairy Co.，Ltd；2 Guangzhou Sino-Lab Biotechnology Co.，Ltd）

Adenosine triphosphate（ATP）can be applied as the marker molecular to a bioluminescence microorganism rapid testing system. ATP reacts with specific patented reagents，releasing fluorescence. By testing the microbial ATP in Ultra High Temperature （UHT）milk or UHT dairy products，microbial contamination can be detected. Comparing with the traditional GB commercial sterilization method，this method is more rapid，sensitive and easy. Validation results show high consistency between the two methods，indicating that ATP bioluminescence method can be used for UHT products rapid screening and release. It implies great signif i cance in quality monitoring and control of UHT milk and dairy products.

Adenosine triphosphate（ATP）；commercial sterility test；ultra high temperature（UHT）sterilization milk；rapid testing

林木娣（1982-），女，大学本科，广东燕塘乳业股份有限公司品控中心食品助理工程师，主管微生物检验和原材料验收工作。

2017-05-15）