DC-CIK与CIK体外培养对包含HBV基因的HepAD38细胞的杀伤效果研究*

龚 觅 舒 丹

DC-CIK与CIK体外培养对包含HBV基因的HepAD38细胞的杀伤效果研究*

龚 觅①舒 丹①

目的：研究乙型肝炎病毒抗原致敏的树突状细胞（DC）和CIK细胞共同培养后对HepAD38细胞（含整合HBV基因组）的杀伤作用。方法：从乙肝患者外周血中提取外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC），平均分为两组，研究组培养DC，培养DC第5天加入乙肝抗原并收获DC，然后加入CIK细胞，培养出DC-CIK细胞；对照组单独培养CIK细胞。两组在培养15 d后分别收获DC-CIK细胞与CIK细胞，同时作为效应细胞，把含有乙肝病毒的HepAD38细胞作为靶细胞，分别在5∶1、10∶1的效靶比时进行杀伤试验，使用LDH释放法测定杀伤活性，并用荧光扩增法检测杀伤试验后培养基内HBV-DNA水平。结果：研究组的DC-CIK细胞的5∶1效靶比时的平均杀伤率为（54.4±6.3）%、10∶1效靶比时的平均杀伤率为（71.5±4.5）%，均明显高于对照组CIK细胞的（42.4±3.0）%、（59.4±4.5）%，差异均有统计学意义（P＜0.05）。研究组的DC-CIK细胞5∶1效靶比时的培养基内的HBV-DNA平均为（1.20±0.30）×106/mL、10：1效靶比时的培养基内的HBV-DNA平均为（1.64±0.60）×107/mL，均明显高于对照组CIK细胞的（0.90±0.23）×106/mL、（1.28±0.23）×107/mL，差异均有统计学意义（P＜0.05）。结论：CIK细胞与DC-CIK细胞对HepAD38细胞均具有杀伤效果，而且随着效靶比的升高，杀伤效果增强。同时，乙肝抗原致敏的DC诱导出的特异性CIK细胞（DC-CIK细胞），能够有效提高CIK细胞对乙肝病毒感染的HepAD38细胞的杀伤作用，其杀伤作用可能与DC被乙肝抗原致敏后诱导出特异性CIK，增强各自疗效有关。

DC； CIK； HepAD38； 效果

慢性乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染是世界范围性质的疾病问题，其中我国是HBV感染的主要国家之一[1]，HBV容易发展成为慢性乙型病毒性肝炎（chronic hepatitis B virus，CHB），而CHB则会发展为肝硬化或者肝癌，一直以来是我国乃至世界人民生命威胁的传染病之一。国内HBV感染多数在围产期或幼年时期发生，因此易产生免疫耐受，体内病毒清除困难，长期的慢性感染还会导致出现各种并发症，因此如何清除HBV是CHB治疗的重难点。目前国内外常规的治疗方法以药物治疗为主，临床上主要采用核苷酸类似物（NAs）与干扰素（IFN）进行抗病毒治疗，这种药物治疗能够有效抑制病毒的复制，但是治疗过程中容易出现病毒耐药、停药复发等情况，难以确定治疗终点[2-3]。

HepAD38细胞是一种可以分泌HBV病毒颗粒的细胞系，因此，理论上对HepAD38细胞进行杀伤可以有效抑制HBV-DNA，达到良好的临床疗效。而CIK细胞对HepAD38具有一定的杀伤力，对CHB具有良好的疗效，患者治疗后其HBV-DNA滴度下降[4]，因此如何诱导针对HBV的特异性CIK细胞来提高对HepAD38细胞的杀伤力是一个研究方向。本文根据大量文献，通过体外培养，以树突状细胞（dendritic cell，DC）诱导出特异性CIK细胞（DC-CIK细胞），来探讨DC-CIK对HepAD38细胞的杀伤及HBV-DNA的抑制效果，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器 外周血选自2016年5-12月本院收治的符合文献[5]中慢性乙型肝炎防治指南的HBeAg阳性CHB患者，采用深圳市金佳禾生物医药有限公司提供的专用培养DC试剂，离心机为贝克曼公司生产提供。

1.2 DC-CIK及CIK培养方法 提取外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC），平均分为两组，每组15份，研究组培养DC细胞，培养DC第5天加入乙肝抗原并收获DC，然后加入CIK细胞，培养出DC-CIK细胞；对照组单独培养CIK细胞。具体方法如下：（1）采集20 mL外周血，密度梯度离心分离PBMC，用AIMV（CTS）培养基调整细胞数目为（4～6）×106个细胞/mL，接种于6孔板内，1 mL/孔，放入培养箱中（37 ℃，CO2浓度为5%）贴壁培养2.5 h。（2）配置DC培养基，DF-01为30X，吸出自然融化的DF-01 400 μL用AIMV（CTS）培养基定容至12 mL备用。（3）取出6孔板，轻摇后将孔内的培养基吸出加入至培养瓶内做CIK培养。用1 mL的CIK培养基滴洗孔板，每孔重复2次，直至显微镜下观察悬浮细胞比例低于5%，将收集的悬浮细胞加入CIK因子（第1天加入γ因子，第2天加入IL-1α、IL-2、CD3），放入培养箱中（37 ℃，CO2浓度为5%）培养CIK细胞，然后每3天换液并补加IL-2因子。（4）每孔加入1 mL的DC培养基，放入培养箱中，记为第0天。（5）第3天，按照步骤2准备DC培养基，每孔补充1 mL。（6）第5天，每孔分别加入50 μL乙肝表面抗原和乙肝e抗原、100 μL DF-02、100 μL DF-03、10 μL DF-04，诱导刺激40～48 h。（7）第7天，吹打6孔板，将悬浮的细胞收集在离心管中，再用预冷的盐水每孔洗涤2次，收集悬浮细胞与CIK混合并继续培养，每3天换培养液并补加IL-2，第14天收获CIK和DC-CIK细胞。

1.3 LDH释放法测定杀伤活性 用96孔板，每孔加入100 μL浓度为1×106/mL的HepAD38细胞，取培养好的CIK和DC-CIK计数，分别配成含量为5×106/mL和1×107/mL的细胞悬液，各加100 μL（效靶比为5∶1、10∶1），放置培养箱中（37 ℃，CO2浓度为5%）培养4 h，离心，吸上清到另一个96孔板内，每孔加试剂盒底物，放培养箱中（37 ℃，CO2浓度为5%），显色30 min，492 nm吸光度测OD值。细胞杀伤率=（检测值-阴性对照/阳性对照-阴性对照）×100%。

1.4 统计学处理 采用SPSS 17.0软件对所得数据进行统计分析，计量资料用（x－±s）表示，比较采用t检验；计数资料以率（%）表示，比较采用 字2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组不同效靶比时的杀伤效果比较 研究组的DC-CIK细胞的5∶1、10∶1效靶比时的平均杀伤率均明显高于对照组的CIK细胞，差异均有统计学意义（P＜0.05），见表1。

表1 两组不同效靶比时的杀伤效果比较 %

2.2 两组不同效靶比时的培养基内HBV-DNA数比较 研究组的DC-CIK细胞5∶1、10∶1效靶比时的培养基内的HBV-DNA均明显高于对照组的CIK细胞，差异均有统计学意义（P＜0.05），见表2。

表2 两组不同效靶比时的培养基内HBV-DNA数

3 讨论

DC及CIK已被应用在诸多肿瘤疾病中[6-7]，王斌等[8]报道称DC与CIK对于结肠癌细胞SW1116均具有良好的杀伤效果，杀伤活性能够达到64.1%与67.7%。杨晓亚等[9]则利用DC诱导CIK特异性细胞对肝癌患者HuH-7细胞具有较强的杀伤活性，而且在相同效靶比时，DC-CIK细胞的杀伤效果明显优于单独CIK细胞，差异均有统计学意义（P＜0.05）。李可等[10]也表示诱导后的DC-CIK细胞对肺癌细胞的杀伤效果较CIK高，而且报告中比较了10∶1、20∶1、50∶1三种效靶比，随着效靶比时的增高，DC-CIK的杀伤效果增强，差异有统计学意义（P＜0.05）。CIK细胞是患者外周血单核细胞（PBMC）在体外用多种细胞因子共同培养一段时间后获得的一群异质细胞[11-12]，其中CD3+、CD56+T细胞群是抗病毒、直接杀伤肿瘤细胞的主要免疫细胞，很早时应用在抗肿瘤过继细胞免疫治疗中[13-14]。应用CIK细胞治疗HBV发现其对HBV-DNA的应答效果很好，CIK对CHB具有良好的临床效果，患者使用这种治疗方法可使HBV-DNA滴度明显降低[4]，而且对一些肝硬化患者自体回输CIK细胞后，其HBV-DNA抑制效果明显变好。因此，CIK细胞对HepAD38具有一定的杀伤力，对于CHB具有效果显著的HBVDNA抑制效果。DC则是人体最重要、功能最强的抗原提呈细胞，能够激发T细胞复制增殖，同时产生免疫应答能力[15-16]。DC捕获HBV后，提呈给CD4+、CD8+T细胞，CD8+T细胞能够对包含HBV的肝细胞中的抗原肽进行识别、活化并与之结合，从而溶解肝细胞进而使肝细胞凋亡。但是DC也能够同时识别并活化机体的NK以及抗体依赖性细胞毒性细胞，从而对CHB患者的肝细胞造成损害[17-18]。因此CHB患者体内的HBV会造成DC数量减少，抗原提呈功能降低，使其分泌细胞因子的能力减弱，T细胞无法起到应答效果。因此，对于CHB患者来说，提高DC的数量对于清除HBV也是非常重要的。

从本文表1中可知，经过诱导后的研究组特异性CIK细胞（DC-CIK）在5∶1效靶比及10∶1效靶比时的杀伤效果为（54.4±6.3）%与（71.5±4.5）%，均比对照组单独CIK的杀伤率高（P＜0.05），而且研究组与对照组的10∶1效靶比相对5∶1效靶比时的杀伤活性更高，这表示随着效靶比的升高，CIK细胞的杀伤效果增强。表2中显示研究组的培养基内检测到的HBV-DNA数明显高于对照组，同时研究组与对照组的10∶1效靶比相对5∶1效靶比时的HBV-DNA检测量多，这是因为免疫细胞杀伤性越强，HepAD38细胞裂解越多，HepAD38细胞内HBV释放到培养基就越多，所以检测出的HBVDNA水平就越高，因此可以说明DC-CIK较CIK有更好的杀伤活性，对HepAD38细胞杀伤效果更好。笔者认为这主要是因为DC-CIK细胞相对于单独的CIK细胞具有更强的免疫活性。DC与CIK细胞共同培养后，DC能够发挥其最大的优势-激活T细胞增殖并建立免疫应答，因此增强了CIK细胞的免疫活性，使其对HepAD38细胞中的HBV-DNA抑制效果更好。而且随着效靶比的增多，杀伤效果增强，这也可以说明当患者体内DC-CIK细胞增多或者HBV-DNA降低时，效果更好，不会有耐性反应。

综上所述，笔者认为HBsAg致敏的DC跟CIK共同培养后诱导出HBsAg的特异性CIK对于HepAD38细胞的杀伤效果更好，其杀伤作用可能与DC被乙肝抗原致敏后诱导出特异性CIK，增强各自疗效有关。

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Study the Killing Effect of DC-CIK and CIK in Vitro on HepAD38 Cells Containing HBV Gene/

GONG Mi，SHU Dan.//
Medical Innovation of China，2017，14（18）：127-130

Objective：To study the killing effect of hepatitis B virus antigen sensitized dendritic cells (DC) and CIK cells on HepAD38 cells (including the integrated HBV genome) after co culture.Method：PBMC was extracted from peripheral blood of hepatitis B patients and divided into two groups，the study group cultured DC，cultured DC for fifth days，added hepatitis B antigen and harvested DC，then added CIK cells to culture DC-CIK cells；the CIK cells were cultured alone in the control group.In the two groups，DC-CIK cells and CIK cells were harvested after 15 d culture，and as the effector cells，the HepAD38 cells containing HBV were used as target cells，in effect the target 5∶1，10∶1 ratio was measured using LDH cytotoxicity assay，cytotoxicity release assay and fluorescence amplification method to detect cytotoxicity after HBV-DNA in the culture medium.Result：The mean killing rate of DC-CIK cells at 5:1，10:1 target ratio in study group were (54.4±6.3)% and （71.5±4.5）%，higher than（42.4±3.0）% and （59.4±4.5）% of control group，the differences were statistically significant（P＜0.05）.The level of HBV-DNA culture medium of 5∶1 cells and 10∶1 cells in the target ratio of DC-CIK in study group were （1.20±0.30）×106/mL and （1.64±0.60）×107/mL，higher than （0.90±0.23）×106/mL and （1.28±0.23）×107/mL of control group，the differences were statistically significant（P＜0.05）.Conclusion：CIK cells and DC-CIK cells have a lethal effect on HepAD38 cells，and the effect target ratio increased，the killing effect is enhanced.At the same time，the hepatitis B antigen sensitized DC induced specific CIK cells （DC-CIK cells），can effectively improve the killing effect of CIK cells on hepatitis B virus infection of HepAD38 cells and its cytotoxicity DC and hepatitis B antigen sensitization induced specific CIK， enhance their curative effect.

DC； CIK； HepAD38； Effect

The Third People’s Hospital of Shenzhen，Shenzhen 518000，China

10.3969/j.issn.1674-4985.2017.18.036

2017-04-12） （本文编辑：张爽）

2015年深圳市科技计划项目

（JCYJ20150402111430634）

①广东省深圳市第三人民医院 广东 深圳 518000

龚觅