献血人群中HCV感染与HLA-II类基因的相关性研究

戴兵 徐罡 王芳 何吉 朱发明

献血人群中HCV感染与HLA-II类基因的相关性研究

戴兵 徐罡 王芳 何吉 朱发明

目的 人类白细胞抗原（HLA）在机体抗病毒免疫中起重要作用，探讨献血人群中丙型肝炎病毒（HCV）感染与HLA-II类基因的相关性。方法 选择2011年10月至2013年10月在浙江省血液中心献血的人员中HCVRNA阳性的样本45例，同时以健康人群为对照，其中HLA-DRB1位点对照样本8 333例，HLA-DRB1位点对照样本72例，用PCR-SBT方法测定献血者HLA-II类基因中DRB1和DQB1等位基因情况。结果 HLA-DRB1基因的DRB1*01:02（P=0.0394，OR=23.4，95%CI=2.89～189.1），DRB1*13:01（P=0.0095，OR=5.60，95%CI：1.74～18.00）；HLA-DQB1基因的DQB1*03:03（P=0.0402，OR=0.45，95%CI：0.21～0.94），DQB1*06:01（P=0.0456，OR=2.47，95%CI：1.05～5.83），这些基因位点的多态性在HCVRNA阳性献血者中的频率与健康对照人群比较有统计学差异。结论 在献血人群中HCV感染与HLA-II类基因中部分多态性位点有相关性。

献血人群 HCV HLA-II类基因

人类白细胞抗原（HLA）基因定位于第6号染色体短臂21.3区域，全长为3 600kb，是目前所知最复杂的多态性遗传系统，具有高度个体特性。HLA基因编码的分子参与抗原的加工与递呈、细胞间识别、抗病毒免疫调节、免疫杀伤等过程，具有重要的免疫功能。国外研究显示[1-4]个体HLA基因型与HCV感染、病毒复制、对药物反应等生物学过程存在一定的相关性。由于HLA基因呈现高度遗传多态性，不同人群不同地区存在明显的不同，而且HCV感染存在着很大的种族和地域上的差异，因此国外的研究数据并不一定适合我国人群。笔者对浙江献血人群中HCV感染与HLA-II类基因相关性进行分析，现报道如下。

1 对象和方法

1.1 对象 选择2011年10月至2013年10月在浙江省血液中心献血的人员HCV RNA阳性样本45例，并随机选取HCV RNA阴性的健康体检者作为正常对照组，其中HLA-DRB1对照组8 333例，HLA-DQB1对照组72例。献血者的选择按照《献血者健康检查标准》[5-6]。

1.2 试剂与仪器 美国Theremo electron corporation 的Forma classⅡA2生物安全柜；美国罗氏公司全自动核酸抽提系统MagNA Pure LC 2.0；美国Thermo Fisher Scientific公司 NanoDrop2000超微量分光光度计（ND2000）；美国ABI3730 DNA测序仪；ABI PCR扩增仪。抽提试剂：罗氏公司MagNA Pure LC DNA Isolation Kit-Large Volume（产品编号：03310515001）；扩增试剂：invitrogen Secore DRB1/DQB1Amp Swquencing kit；测序试剂：invitrogen Secore DRB1/DQB1 locus sequencing Kit。

1.3 基因组DNA的提取 吸取全血样本100μl。使用MagNA LC 2.0全自动核酸分离纯化系统，应用配套MagNA Pure LC DNA Isolation Kit-Large Volume自动抽提试剂盒，严格按仪器使用说明书操作。抽提后的DNA经超微量分光光度计检测DNA浓度和纯度，纯度要求≥1.6，并用不含RNA酶的无菌水调整浓度至15～40ng/μl。

1.4 HLA-DRB1和DQB1基因片段的扩增及测序

1.4.1 HLA-DRB1和DQB1基因片段的扩增 扩增引物为试剂盒内置引物，试剂按试剂盒要求。热循环条件为：预变性2步，95℃、10min，96℃、20s；PCR反应2步，36个循环：60℃、30s，72℃、3min。扩增后用1%琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物。

1.4.2 酶切反应 在每个反应孔中加入3μl ExoSAPIT，混匀离心后经过37℃，25min，80℃，15min的酶切反应后去除反应孔中多余的PCR引物和底物dNTPs，酶切后每孔加入2倍体积的无菌去离子水稀释。

1.4.3 测序反应 在每个反应管/孔中分别加入8μl sequencing mix和2μl Exo SAP-IT处理过的PCR产物，离心混匀。运行热循环程序：预变性：96℃、20s；PCR反应2步，25个循环，50℃、30s，60℃、2min。

1.4.4 测序反应产物纯化 将测序产物用40μl乙醇沉淀，在每个测序反应孔中加入2μl NaAc/EDTA缓冲液。板震荡2min，确保溶液混合均匀，离心3 000×g，30min后。将反应孔倒扣于面巾纸上离心500×g 1min，去除孔内液体。在每个测序反应孔中加入100μl 80%的乙醇溶液。离心3 000×g，5min。将反应孔倒扣于面巾纸上500×g离心1min，去除孔内液体，避光室温干燥20min。

1.4.5 测序反应产物变性 在每个测序反应管中，加入15μl HiDi Formamide 0.3 mM EDTA水溶液，盖白色贴膜，震荡混匀，低速离心。置于PCR仪器上95℃变性2min，反应结束立刻置于冰上3min待温度降下后，上毛细管测序仪进行序列测定。通过分析软件对测序结果进行分析，确定HLA等位基因的位点。与本试剂盒相匹配的分析软件是Assign SBT（Conexio Genomics，Western Australia）。

1.5 统计学处理 献血者HCV RNA阳性人群与对照人群HLA频率分析应用ARLEQUIN Ver 3.5软件（http://cmpg.unibe.ch/software/arlequin3）。应用 Graphpad Prism5.0统计软件，不同人群HLA基因频率的比较采用χ2检验，献血者HCV RNA阳性组与正常对照组HLA多态性危险因素暴露情况采用相对危险度（odd ratio，OR）。

2 结果

2.1 献血者中HCV RNA阳性人群HLA-Ⅱ基因频率分布情况 HCV RNA阳性献血者样本HLA-DRB1和HLA-DQB1基因频率分布见表1～2。

表1 HLA-DQB1在HCV RNA阳性献血中的分布频率

表2 LA-DRB1在HCV RAN阳性献血中的分布频率

2.2 正常对照组HLA-Ⅱ基因频率分布情况 正常对照组中HLA-DRB1和HLA-DQB1基因频率分布数据分布见表3～4。

2.3 献血者HCV RNA阳性组与正常对照组HLA基因频率及特定位点多态性的分析 献血者HCV RNA阳性组及正常对照组HLA等位基因频率分布详见表5～6。HLA-DRB1基因的 DRB1*01:02、DRB1*13:01，HLA-DQB1基因的DQB1*03:03、DQB1*06:01，这些基因位点的多态性在HCV确认感染献血者与正常对照组比较有统计学差异。除HLA-DQB1*03:03为保护性基因外，上述多态性位点均为易感基因。

表3 正常对照组HLA-DRB1的分布频率

表4 正常对照组HLA-DQB1的分布频率

表5 献血者HCV RNA阳性组与正常对照组HLA-DRB1的频率分析

3 讨论

HCV病毒感染并引发肝脏损伤的机制目前尚未完全明确，但有文献报道宿主的HLA遗传多态性与HCV感染、病毒的复制以及肝细胞损伤方面可能存在较大的作用。HLA基因编码的分子参与抗原的加工与递呈、细胞间识别、抗病毒免疫调节、免疫杀伤等过程，具有重要的免疫功能。Cangussu等[7]报道了巴西人中HLA-Ⅱ类等位基因DRB1*11和DQB1*03位点与慢性HCV感染的保护有关，它们可能通过选择病毒表位递呈给CD4+T细胞，从而影响抗病毒的免疫应答效应。Anuradha等[8]报道了印度西部人群中HLA-Ⅰ类等位基因A*03、A*32、B*15、B*55、CW*16、CW*18以及HLA-Ⅱ类等位基因DRB1*03、DQB1*03与HCV感染呈现相关性。上述研究显示HLA基因型与HCV的感染存在一定的相关性，但是目前有关浙江人群HCV感染与个体HLA之间的关系尚缺乏相关的数据。

表6 献血者HCV RNA阳性组与正常对照组HLA-DQB1的频率分析

本实验室采用PCR-SBT的方法分析了献血者HCV RNA阳性及正常对照人群的HLA-Ⅱ类基因的频率分布，发现HLA-DRB1基因的DRB1*01:02、DRB1*13: 01、HLA-DQB1基因的DQB1*03:03、DQB1*06:01基因频率与正常对照人群比较有统计学差异（P＜0.05）。根据OR值情况发现在这些有统计学差异的HLA基因中属于HCV易感基因的为HLA-DRB1*01:02、DRB1*13: 01、HLA-DQB1*06:01，保护性基因为HLA-DQB1*03: 03。既往研究结果中很多为低分辨数据，而本实验室得到的HLA频率数据均为高分辨数据，有一些数据存在差异，这些差异数据更能反应本地区特点，结合HCV生物学特点数据更有利于阐明HLA在献血人群HCV感染中的免疫调节作用，对保障血液安全，探索HLA功能以及研究其与疾病的相关性提供基础数据，具有重要的临床意义。

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[5] 国家质量监督检疫总局《.献血者健康检查要求》(GB18467-2001). 2001.

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Association of HLA-II alleles with hepatitis C virus infection in blood donors

DAI Bing,XU Gang,WANG Fang,et al.Zhejiang Provincial Blood Center,Hangzhou 310052,China

Blood donors Hepatitis C Virus HLA-II alleles

2016-01-01）

（本文编辑：严玮雯）

浙江省医药卫生项目（2016KYA070、2015KYB100）

310052 杭州，浙江省血液中心，卫生部血液安全研究重点实验室，浙江省血液安全重点实验室

朱发明，E-mail：zfm00@hotmail.com

【 Abstract】 Objective To investigate the association of HLA-II alleles with hepatitis C virus(HCV)infection in Zhejiang blood donors. Methods Forty five HCV positive cases were detected by blood nucleotide screening among blood donors in Zhejiang Provincial Blood Center from October 2011 to October 2013.HLA typing was performed with polymerase chain reaction analysis with sequence-based typing(PCR-SBT)in 45 HCVinfected blood donors;the healthy population was used for reference, including 8333 cases for HLA-DRB1 and 72 case for HLA-DQB1. Results The polymorphisms of HLA-II alleles DRB1*01:02 (OR=23.4,95%CI:2.89-189.1,P=0.0394),DRB1*13:01(OR=5.60,95%CI:1.74-18.00,P=0.0095),DQB1*03:03(OR=0.45,95%CI: 0.21-0.94,P=0.0402,),DQB1*06:01(OR=2.47,95%CI:1.05-5.83,P=0.0456)were significantly associated with HCV infection among blood donors. Conclusion Our data suggest that certain HLA-II alleles are associated with HCV infection as a host genetic factor among the Zhejiang blood donors.