陕西省部分地区PRRSV流行毒株ORF3和ORF5基因的遗传变异分析

徐丽美，付明哲，何亚鹏，许信刚，于三科，张 琪

(西北农林科技大学动物医学院，陕西杨凌 712100)



陕西省部分地区PRRSV流行毒株ORF3和ORF5基因的遗传变异分析

徐丽美，付明哲，何亚鹏，许信刚，于三科*，张 琪*

(西北农林科技大学动物医学院，陕西杨凌 712100)

为了解陕西省猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)流行毒株的遗传和变异情况,对9份疑似感染PRRSV的病料用RT-PCR方法分别扩增ORF3和ORF5基因，并进行测序和序列分析。测序结果表明,ORF3基因在254-490和646-737位置之间发生不连续碱基突变；与GenBank已发表的国外毒株ORF3基因组比较，同源性为89.2%～94.8%，与国内发表的ORF3基因比较，同源性为88.8%～99.0%，其中与2009年陕西分离株(HQ843181.1)同源性为94.9%～98.7%，与2010年陕西株(KJ855518.1)同源性为94.9%～98.6%。ORF5基因突变主要在508-600碱基位置之间，与GenBank上已发表的国外毒株ORF5基因组比较，同源性为90.1%～92.1%，与国内发表的ORF5基因比较，同源性为89.6%～99.2%，其中与2009年陕西分离株(HQ843181.1)同源性为95.2%～98.4%，与2010年陕西株(KJ855518.1)同源性为95.2%～98.7%。ORF3和ORF5基因进化树中Wn-2、Ak-3和Tc-4毒株在同一个进化支上，之间亲缘关系近，Xy-1和Hz-5毒株分别在不同的进化分支上，与其他毒株遗传距离较远。陕西省PRRSV流行毒株的ORF5和ORF3基因组与国内PRRSV分离株相比较均有一定变异，且亲缘进化不完全相同。

猪繁殖与呼吸综合征病毒；ORF3基因；ORF5基因；序列分析

猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)引起的感染母猪主要表现为繁殖障碍、仔猪呼吸系统衰竭以及高病死率为特征的一种高度传染性疾病[1]。自1987年美国报道了首例PRRS之后[2]，其他国家也相继报道，2006年我国南方大面积暴发了由PRRS变异株引起的“猪高热病”疫情，当时对我国养猪业造成的影响极大。PRRSV至今与多种病原混合感染，难以判断和检测，随着它给全球养猪业造成的巨大经济损失，迅速上升为全球关注的焦点。PRRSV是不分节段的单股正链RNA病毒，有囊膜，基因组全长约15 kb，有9个开放阅读框，发挥着不同作用[3]。其中ORF3和ORF5分别编码该病毒的囊膜相关糖蛋白GP3和GP5，GP5是PRRSV的主要结构蛋白之一，有较高的免疫原性与中和活性，参与体液、细胞免疫[4]。研究表明，PRRSV分离株间的核苷酸序列存有明显差异，以Nsp2、ORF3和ORF5基因片段变异较大为主[5-7]。很多学着针对ORF5基因进行研究，并探索PRRSV的新型疫苗和分子诊断试剂。由于PRRS是一种急性、热性、高致死性的猪传染病，目前虽已有弱毒疫苗和灭活苗上市可用于PRRS的预防，但免疫效果不佳，因而有必要了解各个省份PRRSV流行株的遗传变异情况。本文就陕西省部分地区检测到的PRRSV的5个流行毒株进行测序并进行遗传变异分析，旨在了解陕西省PRRSV流行毒株之间以及与GenBank已有PRRSV毒株间的遗传变异关系，为陕西省PRRS流行病学调查以及防控提供资料。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病料 采集陕西省杨陵、渭南、安康、铜川、汉中、户县等地区规模化猪场表现为体温高热、耳朵蓝紫、呼吸困难病猪的肺脏、脾脏病料。

1.1.2 主要试剂 Trizol总RNA提取试剂盒(Trizol Reagent)购于天根生化科技有限公司；病毒RNA反转录试剂盒(HiScript®1st Strand cDNA Synthesis)购于诺唯赞生物技术有限公司；2×TaqMasterMix和DNA Marker DL 2 000购于北京康为世纪生物科技有限公司；其他试剂为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 引物设计与合成 根据GenBank已公布的PRRSV序列(KU950375.1、KP771739.1)，针对ORF3和ORF5基因用Primer 5.0各设计一对特异性引物。ORF3上游引物F1 5′-GACAGGGTCAAATGTAACCATAGTGTA-3′，下游引物R1 5′-GTGACATTGGCAGTGATGGTGAT-3′，扩增长度为904 bp，包括ORF3全长开放阅读框基因765 bp。ORF5上游引物F2 5′-TGTGCGACTGCTTCATTT-3′，下游引物R2 5′-CATCACTGGCGTGTAGGT-3′，扩增长度分别为775 bp，包括ORF5全长开放阅读框基因603 bp。引物由Invitrogen上海贸易有限公司合成，置-20℃保存备用。

1.2.2 病毒RNA提取 取病猪肺脏和脾脏，于研磨器中研磨成匀浆，在-20℃/37℃反复冻融3次，8 000 r/min离5 min，取200 μL上清液，按照Trizol Reagent提取试剂盒说明书提取病毒RNA，部分立即用于反转录，剩余的置-80℃保存备用。

1.2.3 RT-PCR扩增 提取的病毒RNA按照(HiScript®1st Strand cDNA Synthesis)试剂盒说明书进行反转录，以反转录的cDNA为模版，总体积50 μL进行PCR扩增。PCR反应参数94℃ 5 min；94℃ 30 s，55℃ 40 s，72℃ 30 s，30个循环；72℃再延伸8 min。

1.2.4 序列测定 将PCR产物进行琼脂凝胶电泳，检测呈阳性样品5份，分别命名为Xy-1、Wn-2、Ak-3、Tc-4、Hz-5，将PCR产物送于上海英俊生物科技有限公司进行序列测定。

1.2.5 序列比对分析 利用DNAStar-MegAlign软件和Blast比对5个毒株的ORF3和ORF5基因组序列并与GenBank已收录的国内外PRRSV毒株进行比对分析，构建核苷酸序列同源性分析表和遗传进化树。

2 结果

2.1 ORF3和ORF5基因PCR扩增结果

分别以PRRSV的RNA反转录的cDNA为模板，经ORF3和ORF5引物PCR扩增得到5个与预期大小一致的目的片段，ORF3基因对应的条带为904 bp(图1)、ORF5基因对应的条带为775 bp(图2)。

2.2 ORF3基因序列同源性分析

应用DNAStar-Meg Align分析软件对5个PRRSV毒株的ORF3基因的核苷酸同源性进行分析，结果见(图3)。全长ORF3基因开放阅读框由765个核苷酸组成，有255个氨基酸。发现5个分离毒株与GenBank上已发表的国外分离株(AB811787.1、AF176348.2、AF325691.1)比较，同源性为89.2%～94.8.0%；与中国其他地区分离株(EU860249.1、HM016159.1、HQ233605.1、KP998431.1、KP998475.1)同源性为88.8%～99.0%，其中与陕西分离株(HQ843181.1、KJ855518.1)同源性为94.9%～98.7%。可以看出ORF3基因具有地缘性差异，一般距离越近同源性越高。

M.DNA 标准 DL 2 000；1～5.ORF3扩增产物

M.DNA Marker DL 2 000；1-5.PCR products of ORF3

图1 ORF3基因PCR扩增

Fig.1 Amplification of ORF3 gene by PCR

M.DNA 标准DL 2 000；1～5.ORF5扩增产物

M.DNA Marker DL 2 000；1-5.PCR products of ORF5

图2 ORF5基因PCR扩增

Fig.2 Amplification of ORF5 gene by PCR

2.3 ORF3基因遗传进化树分析

应用DNAStar-MegAlign生物分析软件完成ORF3基因遗传进化树(图4)，由进化树可以看出，5株中的Wn-2、Ak-3、Tc-4在一个进化小分支上，与陕西株(HQ843181.1)遗传距离较近，Hz-5与陕西株(KJ855518.1)遗传距离较近，Xy-1与北京株(HQ233605.1)遗传关系最近，5个毒株与台湾分离株(KP998431.1)的进化分支最远。

2.4 ORF5基因序列同源性分析

利用DNA Star-Meg Align分析软件对5个PRRSV毒株的ORF5的基因核苷酸进行同源性分析(图5)。ORF5基因由603个核苷酸组成，有201个氨基酸。发现5个毒株的ORF5基因与GenBank上已发表的国外分离株比较，同源性为90.1%～92.1%；与中国分离株(EU860249.1、HM016159.1、KP771760.1、KP998431.1、KP998475.1)同源性为89.6%～99.2%，其中与陕西分离株(HQ843181.1、KJ855518.1)同源性为95.2.8%～98.7%；可以看出ORF5基因也具有地缘性差异，可以看出ORF5基因也具有地缘性差异，一般距离越近同源性越高。

图3 ORF3基因核苷酸同源性分析

2.5 ORF5基因遗传进化树分析

应用DNAStar-MegAlign生物软件完成ORF5基因遗传进化树(图6)，从ORF5基因遗传进化树可看出，5株里面的Wn-2、Ak-3、Tc-4分离株在一个进化分支上，亲缘遗传关系较近，Hz-5与陕西株(KJ855518.1)遗传进化关系近，Xy-1从进化树来看与本地株亲缘进化关系较远，5个毒株与中国台湾分离株(KP998431.1)在进化分支上最远。

图4 ORF3基因核苷酸序列进化树

图5 ORF5基因核苷酸同源性分析

图6 ORF5核苷酸序列进化树

3 讨论

从1987年美国首次报道，随之欧洲多个国家地区PRRS的暴发，1996年郭宝清等[8]在我国首次分离出PRRSV，再到2006年我国南方地区发生的由猪蓝耳病变异病毒引起的大规模的高热病，PRRSV是全球性趋势。目前针对PRRSV的弱毒疫苗和灭活苗已经在猪养殖生产中应用，但由于疫苗自身问题免疫效果不佳，若发病目前尚无特效药物可以进行治疗且呈大规模的暴发，给全球养猪业造成巨大损失。加大对PRRSV的研究迫在眉睫，有必要进行不同地区PRRSV毒株的序列分析、比对，以了解该病毒的遗传、进化及流行情况。

本研究扩增到陕西省部分地区5个毒株的ORF3与ORF5基因。核苷酸同源性分析，5个毒株的ORF3基因之间的同源性为94.9%～98.0%，与GenBank上已发表的国外毒株ORF3基因组比较，同源性为89.2%～94.8.0%，与国内发表的ORF3基因比较，同源性为88.8%～99.0%，与GenBank上已收录的国内外毒株进行核苷酸比对，发现ORF3基因组在254-490和646-737位置之间发生不连续碱基突变。ORF5基因之间的同源性为95.2%～98.4%，与GenBank上已发表的国外毒株ORF5基因组比较，同源性为90.1%～92.1%，与国内发表的ORF5基因比较，同源性为89.6%～99.2%，与GenBank上已收录的国内外毒株进行核苷酸比对，发现突变主要在508-600碱基位置之间。据相关资料已知ORF5是PRRSV基因组中的高突变区之一，这也与本研究得到的结果一致，其编码蛋白GP5又是PRRSV主要的宿主保护性抗原，ORF5基因序列，特别是GP5氨基酸序列的变异将直接降低PRRSV疫苗株的交叉保护率[9]，所以加深ORF5基因的研究势在必行，对本病防控和病毒研究及更有效疫苗研究都很重要。ORF3和ORF5基因进化树中，均呈现出一个规律，Wn-2、Ak-3、Tc-4在一个进化小分支上，亲缘关系较近，Hz-5和Xy-1毒株有别与其他毒株，与本地分离株遗传关系较远，可能这两个地方的流行株与带毒猪的跨地域流动有关。

目前虽投入大量资源进行研究，也已有弱毒疫苗和灭活苗应用于实践，但效果并不是很理想，反而PRRSV一直呈现上升趋势，给养猪业造成巨大经济损失，本研究发现陕西省部分地区PRRSV存在一定的变异，这种变异是否影响疫苗的免疫效果还需要进一步研究。本文针对陕西省部分地区疑似为PRRSV的病猪采取病料，对ORF3和ORF5基因组进行RT-PCR扩增，遗传进化分析，发现陕西省部分地区PRRSV存在一定变异，以补充陕西省地区PRRSV流行株的流行情况，为后续研究奠定基础。

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Genetic Variation Analysis of ORF3 and ORF5 genes of Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus in Partial Regions of Shaanxi Province

XU Li-mei,FU Ming-zhe,HE Ya-peng,XU Xin-gang,YU San-ke,ZHANG Qi
(CollegeofVeterinaryMedicine,NorthwestA&FUniversity,Yangling,Shaanxi,712100，China)

In order to understand the genetics and variation of porcine reproductive and respiratory syndrome virus in Shaanxi province,9 suspected samples of PRRSV infection were collected from pig farms in partial regions,and ORF3 and ORF5 genes were amplified using RT-PCR.Sequencing results showed that the ORF3 gene had discontinuous base mutations between 254-490 and 646-490 positions.Compared with published abroad ORF3 genome in GenBank,the similarity is 89.2%-94.8%,and compared with domestic published ORF3 gene,the similarity is 88.8%-99.0%,compared with 2009 Shaanxi isolate (HQ843181.1),the similarity is 94.9%-98.7%,and with 2010 Shaanxi strain (KJ855518.1), the similarity is 94.9%-98.6%.Sequencing results showed that the ORF5 gene has discontinuous base mutations between 508-600 positions.Compared with published abroad ORF5 genome in GenBank,the similarity is 90.1%-92.1%,and compared with domestic published ORF5 gene,the similarity is 89.6%-99.2%,with 2009 Shaanxi isolate (HQ843181.1), the similarity is 95.2%-98.4%,and with 2010 Shaanxi strain (KJ855518.1),the similarity is 95.2%-98.7%.In ORF3 and ORF5 gene phylogenetic trees,Wn-2,Ak-3 and Tc-4 three strains are in the same evolutionary branch and the genetic distance is farther with Xy-1 and Hz-5 strains.ORF5 and ORF3 genomes all have certain variation of pandemic strains in Shaanxi compared with domestic PRRSV isolates,and biological evolution is not exactly the same.

Porcine reproductive and respiratory syndrome; ORF3 gene; ORF5 gene; sequence analysis

2016-09-21

陕西省农业科技创新与攻关项目(2016NY-095)；西北农林科技大学基本科研业务费项目(Z109021427)

徐丽美(1994-)，女，甘肃会宁人，硕士，主要从事分子病原学与免疫学研究。*通讯作者

S855.1

A

1007-5038(2017)06-0013-05