LPS体外诱导PRP产生PGE2模型的构建及HPLC-FD的优化

朱翔宇，曹志方，杨雨辉，蔡熙姮，姜亚磊，陈 涛

(1.海南大学 农学院，海南海口 570228；2.海南省热带动物繁育与疫病研究重点实验室，海南海口 570228)



LPS体外诱导PRP产生PGE2模型的构建及HPLC-FD的优化

朱翔宇1，曹志方1，杨雨辉2*，蔡熙姮1，姜亚磊1，陈 涛1

(1.海南大学 农学院，海南海口 570228；2.海南省热带动物繁育与疫病研究重点实验室，海南海口 570228)

为了研究花生四烯酸(AA)代谢拮抗剂筛选的新方法，通过模拟体内AA代谢产生前列腺素E2(PGE2)的过程，建立一种新的体外脂多糖(LPS)诱导高浓度血小板血浆(PRP)悬液中AA代谢产生PGE2的炎症模型，并对高效液相色谱-荧光衍生法(HPLC-FD)测定PGE2方法进行了优化。结果表明，经50℃水浴反应，衍生化程度最高， HPLC-FD检测最佳条件为柱温40℃、流动相为添加0.1% 三氟乙酸(TFA)的水∶乙腈(40∶60)，流速1 mL/min，Brmmc-PGE2的保留时间为6.562 min。体外模型试验中LPS+AA诱导试验组(157.476±36.104)ng/mL，LPS诱导空白对照组(11.416±2.034)ng/mL，而AA底物空白对照组中未检测到PGE2。表明AA作为体外PGE2代谢模型的关键底物，在加入诱导物质LPS后，AA可大量代谢生成为PGE2。

前列腺素E2；脂多糖；高效液相色谱；衍生化；荧光检测

前列腺素E2(prostaglandin E2，PGE2)是PG家族众多成员之一，是一种由花生四烯酸(arachidonic acid，AA)经一系列代谢产生的前炎症细胞因子[1]。其普遍存在于动物的组织和体液中，具有广泛的生物学活性，其含量极微，除了在人精液中含量较高外,在其他组织和体液中含量大都在ng级(10-9) 以下[2]。传统试验中对PGE2的测定，多采用酶联免疫试剂盒进行测定；虽然酶联免疫法精密度高，但有着试剂盒价格昂贵、样本要求高和不适合进行大批量样本实验的缺点。20世纪80年代以来国外科学家已对多种PGs的测定有不少报道[3-4]，随着近年来高效液相色谱(high performance liquid chromatography，HPLC)技术的发展，HPLC被应用于检测PG家族化合物；然而正常组织和血液中PGE2的含量最高时也仅仅几纳克，这是HPLC在检测PGE2时具有局限性的主要原因。高效液相荧光检测(high performance liquid chromatography-fluorescence detection，HPLC-FD)是一种有效提高检测效率和响应强度的方法，能够将目标物质通过荧光衍生化转化为具有荧光反应的次级衍生物进行测定，具有高准确度、高响应强度、更低检测浓度的优势[5]。因此，本研究希望通过模拟体内花生四烯酸代谢产生PGE2的过程，建立一种新的体外脂多糖(lipopolysaccharides，LPS)诱导高浓度血小板血浆(platelet-rich plasma，PRP)产生PGE2的模型，并进行了HPLC-FD测定PGE2方法的优化研究。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂 前列腺素E2对照品(纯度≥93%)，购自Sigma公司；双环己基-18-冠醚-6 、4-溴甲基-7-甲氧基香豆素(BrMMC)，购自Sigma公司，用乙腈稀释，配成4 mmol/L的乙腈溶液(下面分别简称衍生试剂A液和B液)避光备用；脂多糖(LPS)和花生四烯酸(AA)标准品，购自Sigma公司；乙腈(色谱纯)，购自TEDIA公司；三氟乙酸(trifluoroacetic acid，TFA)、二水柠檬酸三钠、柠檬酸、葡萄糖，均为国产分析纯。

1.1.2 主要仪器 精密电子天平(XPE105)，购自METTLER TOLEDO公司；低温离心机(Centrifuge 5810R)、高速离心机(Centrifuge 5418)，均购自Eppendorf公司；恒温水浴锅(HH-S4)，购自金坛市医疗仪器厂；隔膜真空抽滤机(GM-0.5A)，购自天津市津腾实验设备有限公司；LC-20AD高效液相色谱仪，配有RF-20A荧光检测器，SIL-20A自动进样器，购自SHIMADZU 公司。

1.2 方法

1.2.1 体外LPS诱导PRP产生PGE2模型的构建

1.2.1.1 血液的前处理及模型的建立 取新鲜血液，第1次离心(1 000 r/min，15 min)，分离收集血清和PRP沉淀。将沉淀血浆PRP重溶于等体积的柠檬酸/葡萄糖溶液(27.35 g二水柠檬酸三钠，0.147 g柠檬酸，27.74 g葡萄糖定容至1 000 mL)。再次离心得到沉淀，沉淀细胞重悬于原体积的Dulbecco's(DPBS)中，得到PRP悬液。

取PRP悬液650 μL/孔，置于48孔板中，均加入50 μL超纯水和75 μL LPS溶液(终浓度为100 ng/mL，以DPBS代替LPS作为诱导空白对照组)，37 ℃温孵15 min。再加入75 μL AA溶液(浓度为0.2 mmol/mL)刺激AA代谢(以等量DPBS缓冲液代替AA作为底物空白对照组)，37 ℃再次温孵15 min。用0 ℃的0.1 mL的1 mol/L HCl溶液终止反应，转入1.5 mL离心管，置-20 ℃保存备用。

1.2.1.2 样品前处理及衍生反应 样品于37 ℃水浴溶解，置于15 mL离心管中，充分混匀后再加入4倍体积的乙酸乙酯，旋涡混合3 min进行提取。4 000 r/min离心10 min，取乙酸乙酯层并干燥除水，于室温下用氮气吹干，复溶于200 μL乙腈中，于-20 ℃下保存备用。测定时,室温下融化后加入衍生试剂进行衍生化处理。

1.2.2 高效液相色谱-荧光衍生法测定PGE2的方法

1.2.2.1 PGE2标准品浓度梯度设置及柱前衍生反应 取PGE2标准品1 mg溶于乙腈中定容至10 mL作为标准品母液，20℃保存备用。以二倍稀释法逐级稀释，得到标准梯度浓度为5 000、2 500、1 250、625、312、156 ng/mL的PGE2标准液。

取各浓度标准液1 mL，分别加入衍生试剂A液和B液各250 μL，再加入无水碳酸钾10 mg，混匀后水浴中避光反应15 min。冷却反应液，3 000 r/min离心10 min，取上层清液1 mL过0.22 μm滤膜后进样10 μL测定。以PGE2的峰面积(A)为纵坐标,质量浓度(C)为横坐标绘制标准曲线,计算回归方程及相关系数。

1.2.2.2 衍生反应及色谱条件的优化 Hypersil BDS C18(5 μm，4.6 mm×250 mm)反向色谱柱；等梯度洗脱：流动相A为水，B为乙腈，均设置添加三个浓度(0%、0.01%、0.1%)的三氟乙酸(TFA)调节pH；激发波长313 nm，发射波长370 nm。柱温箱预设最低温度40 ℃；流速1.0 mL/min。

高效液相色谱-荧光衍生法测定前列腺素E2受多因素影响，根据检测参数的设定，预设衍生温度、柱温、流动相中TFA添加量、流动相B% 4个考查因素，具体设定如表1所示。

广西是一个多民族的以壮族为主体，地处我国西南边陲的地区，在民族迁徙和千百年的融合中，广西地区形成了具有自身特点的耳聋基因突变谱。因此对广西地区耳聋高危人群、患病人群进行分子筛查，查找新致病突变、丰富耳聋突变分子谱，有助于本地区制定相应的耳聋基因筛查策略；指导人群筛查、遗传咨询和临床诊断，并帮助高风险家庭进行产前诊断和医学干预，才能达到提高出生人口素质的目标。

表1 考查因素预设值表

2 结果

2.1 柱前荧光衍生条件对结果的影响

PG家族化合物均无天然荧光,其结构中也缺乏与常见荧光衍生试剂结合的基团，故以4-溴甲基-6.7 -二甲氧基香豆素作为羧酸基团的光衍荧生试剂，在双环己基-18-冠醚-6和碳酸钾催化条件下，与PGE2上的羧基进行衍生化反应，生成具有荧光的PGE2-双香豆素酯[6-8]。因此，衍生化程度对能否完全检测PGE2影响很大。考察了不同衍生温度对PGE2的荧光衍生程度的影响，结果表明(图1)：采用水浴温度50℃时，PGE2的检测响应度最高，即衍生化程度最高。

图1 不同衍生温度对PGE2衍生化程度的影响

2.2 流动相的选择

2.2.1 流动相酸碱度对分离结果的影响 在反相HPLC中色谱峰拖尾是一个普遍的现象，峰拖尾可以引起分离度降低，灵敏度减弱，精密度和定量变差降低，而加入对电子具有竞争性的酸性添加剂可消除拖尾现象[9]。分别考察了添加0%、0.01%、0.1%三个浓度TFA的水和乙腈作为流动相对PGE2的分离情况，并对整个出峰范围和峰型进行了比较。结果表明(表2)：采用添加了0.1% TFA的流动相时，整个方法的精确度最高，且色谱图中各峰分离情况最好，PGE2的峰型无拖尾现象。

表2 流动相中AcCl3不同添加量对精确度及峰型的影响

2.2.2 流动相不同比例对分离结果的影响 通过改变B泵有机相的比例设置，考查了混合后乙腈浓度分别为50%、55%、60%、65%、70% 5个标准进行等梯度洗脱。结果表明(图2)，当乙腈浓度≥55%时即可完全分离各有效峰，且随着乙腈浓度比例的增大，色谱峰的保留时间缩短，但各峰之间的分离度将越差。通过对各峰分离情况及保留时间的分析考虑，乙腈浓度为55%～60%时均可在10 min内出峰，且各峰分离良好，为最佳流动相浓度比例范围。

图2 不同比例的流动相对PGE2分离情况的影响

岛津LC-20AD型高效液相色谱仪可设置的最低柱温为40 ℃，并考虑BDS色谱柱的耐受温度，设置了室温、40 ℃、45 ℃、50 ℃和55 ℃进行比较。结果表明(图3)，室温下因机器内温度变化大，多次测定的保留时间偏差较大，故不考虑以常温作为检测温度；而预设柱温后，仪器内部温度稳定，出峰时间均在6 min～7 min内，温度对保留时间的影响是以0.031 min/℃减少。综合结果及对仪器损耗、保护柱子等多方面考虑，设置柱温40 ℃即可保证保留时间的稳定和检测效率。

2.4 方法的线性范围、精密度与检出限

通过对衍生温度、柱温、流动相pH、流动相比例四个因素进行考查，选择最优检测条件。本法检测的线性范围较宽，拟合标准曲线回归方程，其中x为待测组分标准溶液的浓度，y为相应的色谱峰面积(图4)。并以3倍信噪比计算PGE2的最低检出限，得出最佳检测方法如表3所示。对整个浓度梯度范围的标准品进行了日内、日间差异测定。结果表明(表3)，整个浓度梯度的标准品测定，日内精密度低于7.0%，日间精密度低于4.4%。

图3 不同柱温对PGE2保留时间的影响(N=4)

图4 PGE2液相荧光检测色谱图

2.5 模型构建的结果

本试验分为诱导试验组、诱导空白对照组和底物空白对照组，通过优化后的检测方法，对PRP悬液中PGE2的表达情况进行了测定，其中诱导试验组(157.476±36.104) ng/mL，诱导空白对照组(11.416±2.034)ng/mL，而底物空白对照组中未检测到PGE2。表明AA作为体外PGE2代谢模型的关键底物，在加入诱导物质LPS后，AA可大量代谢生成为PGE2。

表3 最佳检测方法的各项参数

3 讨论

本模型从花生四烯酸代谢系统入手，包括由环氧酶催化形成的前列腺素内过氧化物，这种不稳定、半衰期短的内过氧化物在血栓素异构酶的作用下立即生成血栓素A2(thromboxane A2，TXA2)，TXA2也很不稳定，随即形成稳定的非酶水解产物血栓素B2(thromboxane B2，TXB2)。环氧酶抑制剂可降低TXB2的形成，特异性抑制血栓素异构酶，可立即导致前面所述的内过氧化物的堆积，这一过程是由于其化学性质不稳定性而并不是非酶催化的PGE2前体物生成的结果[10-12]。因而，TXA2-异构酶的抑制可导致PGE2的生成，而TXB2峰值减少。

因此，该模型可作为花生四烯酸代谢拮抗药物的筛选模型，根据代谢途径及物质转化途径，可发展为AA、PGE2、TXB2同时进行定性与定量测定，并进一步研究拮抗剂抑制途径和抑制对象，为抗炎活性成分的初步筛选提供一种快速、精准、简单的有效手段。

表4 各浓度的日内、日间精密度

图5 各组PGE2的表达量情况

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Construction of LPS-induced PGE2ProductioninVitroModel from PRP and Optimization of HPLC With Fluorescence Derivatization Method

ZHU Xiang-yu1,CAO Zhi-fang1,YANG Yu-hui2,CAI Xi-heng1,JIANG Ya-lei1,CHEN Tao1
(1.CollegeofAgriculture,HainanUniversity,Hainan,Haikou,570228,China；2.HainanKeyLabofTropicalAnimalReproduction&BreedingandEpidemicDiseaseControl，Hainan,Haikou,570228,China)

To study the new method of arachidonic acid(AA)metabolic antagonist screening,this article established a new inflammatory modelinvitrolipopolysaccharides(LPS)-induced platelet-rich plasma(PRP)suspension of AA metabolism of prostaglandin E2(PGE2),through the simulation of the metabolism of AA PGE2production in the process,and optimized HPLC with fluorescence derivative method for determination of PGE2.The results showed that By 50℃ water bath reaction,the highest degree in derivatization and HPLC-FD test best conditions were the column temperature 40 ℃,the flow of water to add 0.1% trifluoroacetic acid(TFA):acetonitrile(40∶60),the flow rate of 1 mL/min,Brmmc-PGE2retention time was 6.562 min.Invitromodel,LPS+AA induced test group (157.476±36.104) ng/mL,LPS induced blank control group (11.416±2.034) ng/mL,but PGE2wasn’t detected in AA substrates blank control group.It showed that AA as the key substrateinvitrometabolism of PGE2model,will become the large number of PGE2after adding LPS induced material.

PGE2; LPS; HPLC; derivatized; fluorescence detection

2016-05-31

海南省科技厅“产学研一体化”项目(cxy20150021)

朱翔宇(1995-)，内蒙古人，男，本科，主要从事兽医药理学研究。*通讯作者

S852.2

A

1007-5038(2017)06-0033-05