子宫颈鳞状细胞癌中MCM5和p16INK4A的表达及其意义

冯晓燕， 何 琳，孙志茹

子宫颈鳞状细胞癌中MCM5和p16INK4A的表达及其意义

冯晓燕1， 何 琳2，孙志茹3

目的 探讨HPV 16感染的子宫颈癌中MCM5与p16INK4A表达及其意义。方法 采用RT-PCR及免疫组化SABC法检测HPV 16感染正常子宫颈、子宫颈上皮内病变(cervical intraepithelial neoplasia, CIN)包括CIN 1与CIN 2～3及子宫颈鳞状细胞癌中MCM5、p16INK4A的mRNA及蛋白表达，并分析其临床意义。结果 MCM5、p16INK4AmRNA在子宫颈癌组织中表达均明显高于正常组织(χ2=-6.589，P<0.001；χ2=-4.349，P<0.001)；且随子宫颈病变程度的升高逐渐增加，差异有显著性(χ2=57.141，P<0.001；χ2=47.628，P<0.01)；子宫颈癌中MCM5 mRNA的表达与临床分期、病理分级有关，Ⅰa～Ⅰb期明显低于Ⅱa～Ⅱb期(χ2=-4.93，P<0.01)，其表达随病理分级降低而降低(χ2=-4.017，P<0.01)；子宫颈癌中p16INK4AmRNA表达随病理分级的降低而降低(χ2=8.560，P<0.01)；MCM5、p16INK4AmRNA在子宫颈鳞状细胞癌中表达最明显；MCM5和p16INK4A蛋白表达呈正相关(r=0.497)。结论 子宫颈癌中MCM5和p16INK4A高表达，MCM5可较好的反应子宫颈的恶性增生，与p16INK4A联合检测对完善CIN分级及预后的判断意义重大。

子宫颈肿瘤；鳞状细胞癌；p16INK4A；MCM5

人乳头瘤病毒(human papillomavirus, HPV)感染在子宫颈上皮内病变(cervical intraepithelial neoplasia, CIN)逐渐转变为子宫颈癌的过程中发生重要作用[1-3]。早期发现癌前病变中异常水平的分子标志物对子宫颈癌筛查的意义重大。MCM5是DNA复制过程中发挥重要作用的一类蛋白，其功能的正常与否和微染色体有丝分裂稳定性关系密切[4]。p16INK4A属于抑癌基因，和细胞周期调控关系密切，与多种肿瘤的发生、发展相关[5]。目前，关于MCM5与p16INK4A在子宫颈癌发生、发展中的表达及其相互作用机制报道较少[6]。本文检测不同程度子宫颈病变和子宫颈鳞状细胞癌中MCM5、p16INK4A的表达，探讨两者在HPV 16感染子宫颈鳞状细胞癌发生、发展中的作用，为完善癌前筛查及预后判断提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 临床资料 收集河北省保定市第二医院2014年2月～2016年2月活检确诊为子宫颈鳞状细胞癌50例，低度子宫颈上皮内病变(CIN 1级)14例，高度子宫颈上皮内病变(CIN 2～3级)18例。患者年龄38～64岁，平均(40.5±5.8)岁，其中40岁及以上者31例，小于40岁者19例。根据国际妇产科联盟的临床分期标准[7]：Ia期6例，Ib期12例，Ⅱa期14例，Ⅱb期18例。所有患者均确诊为HPV 16单一感染，术后经病理确诊，术前均无放、化疗及其他药物治疗。选择同时段收治的HPV 16单一感染、子宫脱垂住院患者行子宫完整切除后病理提示正常子宫颈组织20例为对照组。获取标本后分为2份，1份经10%中性福尔马林固定后石蜡包埋；1份冻存于液氮中备用。本实验经河北省保定市第二医院伦理委员会批准，患者均签署知情同意书。

1.2 引物设计 上海宝生物公司合成p16INK4A和MCM5引物；上海生物工程公司合成内参β-actin。p16INK4A上游引物：5′-CCCCACTACCGTAAATGTCCA-3′，下游引物：5′-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3′；MCM5上游引物：5′-GAGATGCCCAGACACATGCAG-3′，下游引物：5′-ATGGAGTAGATGCCCATGATGGTA-3′；β-actin上游引物：5′-TCGTGCGTGACATTAAGG-3′，下游引物：5′-AGGAAGGAAGGATGGAAG-3′。

1.3 RT-PCR

1.3.1 提取总RNA与合成cDNA 取样本50 mg提取总RNA，测其纯度(紫外分光法)，予以A260/A280位于1.8～2.2的标本按逆转录试剂盒说明书进行反转录，将500 ng总RNA加入20 μL反应体系中，反映条件为37 ℃ 15 min、85 ℃ 5 s、4 ℃延伸，获得cDNA后行PCR检测或冰箱保存(-20 ℃)备用。

1.3.2 RT-PCR检测 ABI 7500 RT-PCR仪对MCM5 mRNA与p16INK4AmRNA的相对表达量进行检测，具体操作步骤按试剂盒说明书进行。PCR反应体系(20 μL)：2 μL cDNA、95 ℃预变性30 s；PCR循环40次，95 ℃ 5 s、60 ℃ 20 s。溶解并绘制溶解曲线：90 ℃ 1 min、65 ℃ 15 s、37 ℃ 30 s。

1.4 免疫组化 取切片脱蜡、水化、高压热抗原修复后采用免疫组化SABC法进行染色，具体操作步骤按试剂盒说明书进行。阴性对照组采用PBS缓冲液替代一抗。MCM5蛋白以细胞核着色呈棕黄色为阳性，其中阳性细胞数<10%为阴性，10%～30%为弱阳性，31%～70%为中度阳性，>70%为强阳性。p16INK4A蛋白以细胞核和(或)细胞质着色呈棕黄色为阳性，其中阳性细胞数<10%为阴性，10%～30%为弱阳性，31%～60%为中度阳性，>60%为强阳性。

2 结果

2.1 MCM5、p16INK4AmRNA在HPV 16感染后不同子宫颈组织中的表达 采用RT-PCR检测MCM5、p16INK4A基因、内参的溶解曲线峰，结果显示均为明显单峰。MCM5 mRNA的相对表达量随子宫颈病变的程度升高逐渐增加，差异有显著性(χ2=57.141，P<0.001)。MCM5 mRNA在子宫颈鳞状细胞癌组中表达量明显高于正常组及各级别子宫颈病变组，差异均有显著性(χ2=-6.589，χ2=-5.524，χ2=-4.473；P<0.001)；MCM5 mRNA在CIN 1组与CIN 2～3组相比差异无显著性(χ2=4.0.107，P>0.05)。p16INK4AmRNA的相对表达量随子宫颈病变程度升高而增加，差异有显著性(χ2=47.628，P<0.01)。p16INK4AmRNA在子宫颈癌中表达显著高于正常组(χ2=-4.349，P<0.001)；p16INK4AmRNA在子宫颈癌组与CIN 2～3组相比差异无显著性(χ2=-1.572，P>0.05)。p16INK4AmRNA在CIN1组中表达与正常组相比差异无显著性(χ2=-1.217，P>0.05)；与CIN 2～3组相比差异有显著性(χ2=-3.54，P<0.01，图1)。

图1 MCM5(A)、p16INK4A mRNA(B)在HPV 16感染后不同子宫颈组织中的表达

2.2 p16INK4A、MCM5 mRNA的表达与子宫颈癌临床病理特征的关系 子宫颈癌中MCM5 mRNA的表达与患者年龄无关(χ2=-0.241，P>0.05)；与临床分期有关，MCM5 mRNA表达量Ⅰa～Ⅰb期明显低于Ⅱa～Ⅱb期(χ2=-4.93，P<0.01)；与病理分级有关，表达量随病理分级降低而降低(χ2=-4.017，P<0.01)。子宫颈癌中p16INK4AmRNA表达与患者年龄(χ2=-1.079，P>0.05)、临床分期均无关(χ2=2.001，P>0.05)；与病理分级有关，随病理分级的降低而降低(χ2=8.560，P<0.01，表1)。

2.3 HPV 16感染后不同子宫颈组织中MCM5、p16INK4A蛋白的表达 MCM5蛋白阳性定位于细胞核呈棕黄色，在子宫颈正常组织中无着色或仅为弱表达，限于基底层。随着CIN病变程度加深，阳性表达细胞升高，范围增大，染色增强，鳞状细胞癌组织呈弥漫表达(图2)。p16INK4A蛋白阳性定位于细胞核和(或)细胞质呈棕黄色，在正常组织中几乎不表达。随CIN病变程度加深，阳性表达细胞升高，范围增大，染色增强，鳞状细胞癌组织呈弥漫表达，染色以强阳性为主(图3)。MCM5在不同子宫颈组织中表达随病变程度升高逐渐增加，差异有显著性(P<0.01)；其中在子宫颈鳞状细胞癌中表达显著高于正常及各程度子宫颈病变组织(P<0.05)；CIN 1组与CIN 2～3组相比，MCM5蛋白表达差异无显著性(P>0.05)。p16INK4A在不同子宫颈组织中表达随病变程度升高逐渐增加，差异有显著性(P<0.01)；在CIN 2～3组中的表达显著高于正常组及CIN 1组(P<0.05)，与鳞状细胞癌组相比差异无显著性(P>0.05，表2)。

②A②B②C③A③B③C

图2 MCM5在不同子宫颈病变中的表达，SABC法：A.CIN 1组；B.CIN 3组；C.子宫颈鳞状细胞癌组 图3 p16INK4A在不同子宫颈病变中的表达，SABC法：A.CIN 1组；B.CIN 3组；C.子宫颈鳞状细胞癌组

表1 p16INK4A 、MCM5 mRNA表达与子宫颈癌临床病理特征的关系

表2 不同子宫颈组织中MCM5和p16INK4A的表达

采用χ2检验及Fisher确切概率法；MCM5蛋白的表达：与正常组相比，aP<0.05；与CIN 1组相比，bP<0.05；与CIN 2～3组相比，cP<0.05；p16INK4A蛋白的表达：与正常组相比，xP<0.05；与CIN 1组相比，yP<0.05；与CIN 2～3组比较，zP<0.05

表3 MCM5、p16INK4A蛋白表达及与子宫颈癌临床病理特征的关系

采用MannWhitneyU检验和Kruskal-WallishH检验

2.4 MCM5、p16INK4A蛋白表达与子宫颈癌临床病理特征的关系 子宫颈鳞状细胞癌中MCM5蛋白表达和病理分级及临床分期相关(P<0.01)；与患者年龄无关(P>0.05)。p16INK4A的表达和病理分级有关(P<0.05)；与临床分期及患者年龄均无关(P>0.05，表3)。

2.5 子宫颈癌中MCM5、p16INK4A蛋白表达的相关性 采用Spearman秩相关性分析显示：子宫颈鳞状细胞癌中MCM5和p16INK4A蛋白表达呈正相关(r=0.497，P<0.01，表4)。

表4 子宫颈癌中MCM5、p16INK4A蛋白表达的相关性

3 讨论

HPV基因基本结构包括早、中、晚3个重要区域，是一种双链环状DNA病毒，其中HPV感染细胞的恶变常与早期基因区域及其产物E6、E7的表达异常相关[8]。HPV 16是全球公认的引起子宫颈鳞状细胞癌最重要基因型[9-10]。因此，本实验选择HPV 16单一感染的子宫颈病变组织，并对不同程度CIN及子宫颈鳞状细胞癌中MCM5、p16INK4A表达进行检测，对其在子宫颈鳞状细胞癌发生、发展中的作用及其临床病理特征的关系进行探讨。

MCM蛋白在DNA复过制程中有重要意义，为高度保守的蛋白质，与细胞增殖关系密切，可随细胞分裂周期出现周期性的表达上调与下调[11-12]。本组结果显示，MCM5蛋白及mRNA在CIN 1组中均呈阳性，其阳性细胞数随病变程度增加而上升，表达范围从基底层逐渐向表层推移；与Chew等[13-14]报道结果相符。进一步提示MCM5的异常表达与子宫颈癌的发生、浸润等过程密切相关。

本组MCM5 mRNA及蛋白在子宫颈正常组中的表达明显低于各级CIN组及子宫颈鳞状细胞癌组；子宫颈鳞状细胞癌中的表达明显高于CIN 2～3组。提示上调的MCM5标志潜在恶性细胞和非典型细胞的增生，与Zhang等[15-16]的报道结果相符。

有研究显示[17]，子宫颈涂片中应用MCM5抗体检测进行恶变潜能细胞的诊断其敏感性和特异性均较高。本组CIN 2～3组中MCM5蛋白及mRNA的表达与CIN 1组相比，差异均无显著性。因此，作者认为尚不能根据MCM5表达的改变来进行CIN程度分级。

文献报道显示[18-20]，p16INK4A在多种肿瘤中均不表达或低表达，但在子宫颈癌组织中呈高表达。本实验结果显示，p16INK4AmRNA在正常子宫颈组织中未见明显表达，而在各级CIN及子宫颈鳞状细胞癌组织中其表达量及范围随子宫颈病变程度的升高逐渐增加，与Zhang等[21]的报道一致。本组实验发现，MCM5和p16INK4A蛋白在子宫颈鳞状细胞癌中表达呈正相关，提示两者在HPV 16感染子宫颈鳞状细胞癌发生、发展中可能存在协同作用。由于目前临床相关研究仍相对较少，MCM5和p16INK4A在子宫颈癌中的表达与肿瘤发生、发展的相关性及其作用机制，仍有待于深入分析。

综上所述，联合检测MCM5和p16INK4A可以协助判断细胞增殖状态、CIN程度，以及筛查出具有潜在恶性的CIN，并对预测病情发展及CIN转归的关系意义重大，与HPV的联合检查提高癌前病变及子宫颈癌的筛查阳性率。

[1] Petry K U, Cox J T, Johnson K,etal. Evaluating HPV-negative CIN2+ in the ATHENA trial[J]. Int J Cancer, 2016,138(12):2932-2939.

[2] 吕秀芳，宋晓霞，贺 慧，等. HPV DNA、E6/E7 mRNA在各子宫颈病变及子宫颈鳞状细胞癌中的表达[J]. 临床与实验病理学杂志, 2016,32(7):745-748.

[3] 谭 琪，章任兵，王静霞，等. 高危型人乳头瘤病毒感染的子宫颈非典型鳞状细胞中p16基因的缺失[J]. 临床与实验病理学杂志, 2015,31(6):687-689.

[4] White T E, Surles-Zeigler M C, Ford G D,etal. Bilateral gene interaction hierarchy analysis of the cell death gene response emphasizes the significance of cell cycle genes following unilateral traumatic brain injury[J]. Bmc Genomics, 2016,17(1):1-29.

[5] Rosemann M, Gonzalez-Vasconcellos I, Domke T,etal. A Rb1, promoter variant with reduced activity contributes to osteosarcoma susceptibility in irradiated mice[J]. Mol Cancer, 2014, 13(1):182.

[6] Jorge V R, Silva M R, Guillin E A,etal. The origin and genetic diversity of the causal agent of Asian soybean rust, phakopsora pachyrhizi, in South America[J]. Plant Pathol, 2014,64(3):729-737.

[7] Choi J W, Kim Y, Lee J H, Kim Y S. The clinical performance of primary HPV screening, primary HPV screening plus cytology cotesting, and cytology alone at a tertiary care hospital[J]. Cancer Cytopathol, 2015,124(2):144-152.

[8] Hesselink A T, Sahli R, Berkhof J,etal. Clinical validation of anyplex II HPV HR detection according to the guidelines for HPV test requirements for cervical cancer screening[J]. J Clin Virol, 2016,76(2):211-225.

[9] Jones R W. The natural history of cervical and vulvar intraepithelial neoplasia[J]. Am J Obstet Gynecol, 2010,202(3):e12-e13.

[10] Iwao K, Seiichiro M, Satoru A,etal. Hypermutation in the E2 gene of human papillomavirus type 16 in cervical intraepithelial neoplasia[J]. J Med Virol, 2015,87(10):1754-1760.

[11] Dijkstra M G, Heideman D A, de Roy S C,etal. pl6(INK4a) immunostaining as an alternative to histology review for reliable grading of cervical intraepithelial lesions[J]. J Clin Pathol, 2010,63(11):972-977.

[12] 高 峻，杨 勇，陈 霖，等. STK15、MCM5在胃癌前病变及癌变组织中的表达及相关性分析[J]. 实用医学杂志, 2014,9:1432-1434.

[13] Chew I, Post M D, Carinelli S G,etal. p16 expression in squamous and trophoblastic lesions of the upper female genital tract[J]. Int J Gynecol Pathol, 2010,29(6):513-522.

[14] 郭 冲，尹格平. MCM5蛋白和hTERC基因检测在预测CIN恶性潜能的价值[J]. 现代肿瘤医学, 2014,22(11):2696-2701.

[15] Zhang J L, Wang L, Qiu M,etal. The protein levels of MCM7 and p63 in evaluating lesion severity of cervical disease[J]. Int Gynecol Cancer, 2013,23(2):318-324.

[16] 刘丽娜，李 瑶，杨永秀，等. MCM5和p16INK4A在宫颈鳞状细胞癌组织中的表达及其临床意义[J]. 西安交通大学学报(医学版), 2015,36(6):829-835.

[17] Zheng J. Diagnostic value of MCM2 immunocytochemical staining in cervical lesions and its relationship with HPV infection[J]. Int J Clin Exp Pathol, 2015,8(1):875-880.

[18] Schlichte M J, Guidry J. Current cervical carcinoma screening guidelines[J]. J Clin Med, 2015,4(5):918-932.

[19] 潘琼慧，黄凌霄，陈育梅，等. p16INK4A、L1壳蛋白联合检测在子宫颈鳞状上皮内病变中的应用研究进展[J]. 实用医学杂志, 2015,31(2):324-326.

[20] von Knebel Doeberitz M, Reuschenbach M, Schmidt D,etal. Biomarkers for cervical cancer screening: the role of p16(INK4a) to highlight transforming HPV infections[J]. Expert Rev Proteomics, 2012,9(2):149-163.

[21] Zhang C Y, Bao W, Wang L H. Downregulation of p16(ink4a) inhibits cell proliferation and induces G1cell cycle arrest in cervical cancer cells[J]. Int J Mol Med, 2014,33(6):1577-1585.

Expression and significance of MCM5 and p16INK4Ain cervical squamous cell carcinoma

FENG Xiao-yan1, HE Lin2, SUN Zhi-ru3

(1DepartmentofNuclearMedicine,2DepartmentofGynaecologyandObstetrics,theNo.2HospitalofHebeiProvinceBaoding,Baoding071051,China;3DepartmentofGynaecologyandObstetrics,DingxingCountyYunfengMaternityHospitalofHebeiProvince,Dingxing072650,China)

Purpose To investigate the expression and significance of MCM5 and p16INK4Ain cervical carcinoma and cervical intraepithelial neoplasia (CIN 1, CIN 2～3 ) with different degrees of HPV 16 infection. Method RT-PCR and immunohistochemistryof SABC method were used to detect the expression of mRNA and protein in HPV 16 infected normal cervix, CIN 1 tissue, CIN 2～3 tissue and cervical squamous cell carcinoma and analyzed the clinical significance. Result The expression of p16INK4Aand MCM5 mRNA in cervical cancer tissues were significantly higher than that in normal tissues (χ2=-6.589,P<0.001, χ2=-4.349,P<0.001). The degree of cervical lesions increased gradually (χ2=57.141,P<0.001, χ2=47.628,P<0.01). Expression of mRNA MCM5 was correlated with pathological grade and clinical stage. Ⅰa-Ⅰb period was

significantly lower than that of Ⅱa-Ⅱb (χ2=-4.93,P<0.01), the expression decreased with the decrease of pathological grade (χ2=-4.017,P<0.01). The expression of p16INK4AmRNA in cervical cancer decreased with the decrease of pathological grade (χ2=8.560,P<0.01). The most obvious expression of p16INK4Aand p16INK4AmRNA in squamous cell carcinoma. Expression of MCM5 protein and p16INK4Aprotein in cervical squamous cell carcinoma was positively correlated (r=0.497). Conclusion There is high expression of MCM5 and p16INK4Ain cervical carcinoma. MCM5 can be a better reaction of cervical malignant hyperplasia, and p16INK4Ajoint detection for the improvement of CIN classification and prognosis of the significance of the judgment.

cervical neoplasm；squamous cell carcinoma；p16INK4A； MCM5

1河北省保定市第二医院核医学科、2妇产科 0710513河北省定兴县云峰妇产医院妇产科 072650

冯晓燕，女，主管技师。E-mail： yhfeng99@126.com

时间：2017-5-17 23:53 网络出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20170517.2352.010.html

R 737.33

A

1001-7399(2017)05-0515-06

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.05.010

接受日期：2017-03-02