DAPT在ox-LDL损伤HUVECs过程中的细胞保护作用*

任开新， 樊子旭， 游如春， 韩蔚珉， 张 然， 黄 锐， 闫国良， 张 业

(厦门大学医学院， 福建 厦门 361102)

·短篇论著·

DAPT在ox-LDL损伤HUVECs过程中的细胞保护作用*

任开新， 樊子旭， 游如春， 韩蔚珉， 张 然， 黄 锐， 闫国良∆， 张 业∆

(厦门大学医学院， 福建 厦门 361102)

目的： 探究γ-分泌酶抑制剂N-[N-(3,5-difluorophenacetyl)-L-alanyl]-S-phenylglycine t-butyl ester(DAPT)在氧化低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein，ox-LDL)损伤人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)模型中的细胞保护作用及其对Notch信号通路的调控。方法: 体外培养HUVECs，用ox-LDL处理HUVECs构建细胞损伤模型。实验分为对照组、ox-LDL处理组、DAPT处理组和DAPT+ox-LDL处理组。用倒置相差显微镜观察不同处理方法下细胞的形态变化；CCK-8法检测细胞存活率；Western blot法检测蛋白Notch1、Notch4和Jagged1的表达情况。结果: 体外培养HUVECs，倒置相差显微镜下发现ox-LDL处理组细胞死亡和碎片增多，经DAPT预处理后，ox-LDL作用造成的细胞损伤死亡较少，细胞碎片较少。通过CCK-8法检测发现ox-LDL处理组细胞存活率降低，DAPT处理组细胞存活率升高，DAPT预处理后ox-LDL造成存活率降低的幅度变小。在ox-LDL作用下，Notch1和Jagged1蛋白表达量降低，Notch4表达量升高；而DAPT作用下Notch1和Jagged1表达量升高，Notch4表达量降低；ox-LDL与DAPT共同作用时蛋白接近正常水平。结论: ox-LDL对HUVECs具有损伤作用； DAPT减轻ox-LDL对HUVECs造成的损伤； DAPT保护HUVECs免受ox-LDL损伤的作用与Notch信号通路有关。

人脐静脉内皮细胞； 氧化低密度脂蛋白； DAPT； Notch信号通路

血管内皮细胞是血管壁的主要屏障，当血管内皮细胞损伤时，会导致泡沫细胞形成，从而诱发动脉粥样硬化的发生发展，此外，当血管内皮细胞的屏障作用缺失时，会引发血小板聚集、凝血，促进血栓性疾病的发生[1-2]。目前许多研究发现氧化低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein，ox-LDL)可以造成血管内皮细胞损伤，是动脉粥样硬化等许多心血管疾病发生发展的一个重要因素[3]。有研究表明ox-LDL可以激活Notch信号通路促进巨噬细胞激活引起炎症反应[4]，我们由此推测两者在血管内皮细胞中也有一定的关联。既往关于Notch信号通路在血管中的研究主要集中于新生血管发育与成熟的过程，但是缺乏在ox-LDL损伤血管内皮细胞过程中是否具有保护作用的相关研究。同时，γ-分泌酶抑制剂N-[N-(3,5-difluorophenacetyl)-L-alanyl]-S-phe-nylglycine t-butyl ester (DAPT)可以抑制Notch信号通路上的相关位点[5]。因此我们推测ox-LDL损伤血管内皮细胞时可能与Notch信号通路有关联，并且DAPT对血管内皮细胞可能具有一定的保护作用。本研究以体外培养人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)为研究模型，研究DAPT在ox-LDL损伤HUVECs过程中是否具有细胞保护作用，以及DAPT对Notch信号通路的调控情况。

材 料 和 方 法

1 材料

人脐静脉内皮细胞株(ATCC)由厦门大学医学院器官移植研究所李成林博士惠赠。

2 主要试剂

培养基DMEM/F-12购自HyClone；人表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)购自 PeproTech；anti-Notch1抗体、anti-Notch4抗体和anti-Jagged1抗体均购自Abcam；氧化低密度脂蛋白购自广州奕源生物公司；DAPT购自Sigma；Cell Counting Kit-8 (CCK-8)购自Dojindo。

3 主要方法

3.1 HUVECs体外培养 HUVECs培养在DMEM/F-12培养基中，其中含7%的优质胎牛血清和EGF 5 μg/L，置于37 ℃、5% CO2培养箱中。待细胞铺满培养皿时传代，吸去培养液，用PBS轻柔洗2次，胰酶消化2～3 min，待细胞脱落后，加入适量培养基终止胰酶的消化作用，收集细胞于离心管中，离心1 000 r/min、3 min，弃上清，用新的培养基1 mL重悬细胞，按1∶5接种于新培养基中。

3.2 药物处理和分组 (1)对照组：正常培养24 h；(2)DAPT处理组：待细胞贴壁后给予25 μmol/L DAPT作用24 h；(3)ox-LDL处理组：同一批细胞贴壁后12 h给予100 mg/L ox-LDL作用12 h；(4)DAPT+ox-LDL处理组：待同一批细胞贴壁后先给予25 μmol/L DAPT预处理12 h，再给予100 mg/L ox-LDL作用12 h。

3.3 细胞形态学观察 将贴壁长满的HUVECs用胰蛋白酶进行消化，细胞悬液接种于直径2 cm的培养皿，细胞密度1×105/L，每皿1 mL，按以上分组给药。培养箱培养孵育后倒置相差显微镜下观察。

3.4 CCK-8法检测细胞活力 胰酶消化HUVECs，以每孔8×103个接种于96孔板。按常规培养方式复苏细胞活力2 h，待细胞贴壁后给药，按分组给药。药物处理后用PBS洗去含药培养基，每孔加入新培养基100 μL及CCK-8试剂10 μL，孵育120 min。用酶标仪测定各孔在450 nm处的吸光度(A)值，各组的A值取均数用于计算细胞存活率。计算公式：细胞存活率(%) =(药物处理组A值-空白组A值)/(无药物处理组A值-空白组A值)×100%。

3.5 Western blot检测相关蛋白变化 取HUVECs 1×108/L接种于10 cm培养皿，按分组给药。培养后用RIPA裂解液，含1×cocktail裂解细胞，并用细胞刮子充分刮下贴壁细胞，收集后摇床上冰水浴摇晃45 min，12 000×g、4 ℃ 离心10 min取上清。取蛋白样品5 μL，用BCA试剂盒测定样品浓度。余下部分加入loading buffer 煮沸5 min，-20 ℃冻存，留待上样。各个蛋白样品取30 μg上样，10% SDS-PAGE，湿转至硝酸纤维素膜，5%脱脂奶粉封闭1 h，TBST洗膜 6 min×3次。室温孵育 I 抗(Notch1 1∶2 000， Notch4 1∶1 000， Jagged1 1∶1 000)1 h，TBST洗膜6 min×3次。加入辣根过氧化物酶标记的兔抗人IgG(Notch1 1∶2 000， Notch4 1∶250， Jagged1 1∶1 000)室温孵育1 h，TBST洗膜6 min×3次。加入现配制的ECL显色液，避光2 min，贴膜曝光。以β-actin蛋白作为内参照，用ImageJ灰度分析后行统计学处理。

4 统计学处理

用SPSS 19.0统计软件进行分析。数据均采用均数±标准差(mean±SD)表示，多组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，组间两两比较采用SNK-q检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 药物对细胞形态学的影响

对照组的脐静脉内皮细胞的细胞胞浆丰富，胞核大，细胞间连接紧密，边界清楚，呈单层铺路石状排列，细胞呈多角形、梭形或卵圆形。ox-LDL处理组细胞分解死亡，细胞碎片增多。DAPT处理组和对照组无明显区别，细胞排列紧密整齐。经过DAPT预处理12 h后再给ox-LDL作用12 h组，细胞较ox-LDL组死亡较少，碎片较少，见图1。

Figure 1.The light-microscopic images of HUVECs 24 h after treatment (×200).

图1 药物对细胞形态影响

2 CCK-8法检测细胞存活率

CCK-8法检测细胞存活率结果显示，与对照组相比，ox-LDL组细胞存活率下降，DAPT处理组细胞存活率升高，差别具有统计学显著性(P<0.05)；经过DAPT预处理后加入ox-LDL的细胞与ox-LDL处理组相比存活率升高，差异具有统计学显著性(P<0.05)，而与对照组相比，其差异无统计学显著性，见图2。

3 Western blot法检测蛋白变化

Western blot实验结果显示，Jagged1和Notch1在DAPT影响下表达降低，在ox-LDL影响下表达增加，与对照组相比差异具有统计学显著性(P<0.05)，而经过DAPT预处理后，ox-LDL对Jagged1和Notch1表达的影响变小，与对照组相比，差异无统计学显著性；相反地，蛋白Notch4在DAPT影响下表达升高，在ox-LDL影响下表达降低，与对照组相比差异具有统计学显著性(P<0.05)，而经过DAPT预处理后，ox-LDL对Notch4表达的影响变小，与对照组相比，差异无统计学显著性，见图3。

Figure 2.The viability of the HUVECs treated with DAPT, ox-LDL and in combination. Mean±SD.n=4.*P<0.05vscontrol group;△P<0.05vsDAPT group;#P<0.05vsox-LDL group.

图2 DAPT干预条件下ox-LDL对HUVECs存活率的影响

Figure 3.The changes of protein expression of Notch1, Notch4 and Jagged1. Mean±SD.n=4.*P<0.05vscontrol group;△P<0.05vsDAPT group;#P<0.05vsox-LDL group.

图3 药物对蛋白表达的影响

讨 论

内皮细胞功能障碍是许多心血管疾病的始动环节，如动脉粥样硬化，血栓形成等，而已有的研究表明ox-LDL是诱导血管内皮功能受损的重要因素。因此研究ox-LDL对血管内皮细胞损伤的机制以及寻找保护血管内皮细胞免受ox-LDL损伤具有重要意义。

我们以不同浓度的ox-LDL处理HUVECs，发现随着浓度增加，ox-LDL对细胞的损伤程度逐渐加大，与相关研究结果一致[6]。对于ox-LDL损伤血管内皮细胞的机制，以往研究发现其通过与细胞上的凝集素样氧化性低密度脂蛋白受体-1结合而使血管内皮细胞损伤[7-8]。其中，ox-LDL可以通过细胞内信号转导激活NF-κB，降低内皮型一氧化氮合酶活性，减少一氧化氮生成，同时增加乳酸脱氢酶和白细胞介素-8的释放和环氧化酶-2的表达，引起内皮细胞功能障碍[9-10]。但是目前国内外缺乏关于ox-LDL对血管内皮细胞损伤过程中Notch信号通路影响的研究。

Notch信号通路广泛存在几乎所有细胞，调控着不同细胞的增殖、分化和凋亡，对不同的器官组织发挥不同效应[11-12]。Notch 信号通路在相邻细胞之间通过配体与受体相互结合而影响细胞的增殖、分化和凋亡，人源细胞中配体包括Delta样配体(Dll1、3、4)与Jagged(Jagged1、2)，受体包括Notch1～4[13]。近来研究表明，Notch信号通路和动脉粥样硬化等心血管疾病的发生发展也有密切关系[14]。同时也有研究表明在ox-LDL刺激巨噬细胞过程中，Notch信号通路受体Notch1升高，可以增加NF-κB的活性，从而损伤巨噬细胞[15]。因此我们推断在血管内皮细胞损伤过程中，ox-LDL与Notch信号通路存在相关联系，而Notch信号通路抑制剂DAPT可以保护HUVECs免受ox-LDL损伤。

我们通过实验，发现DAPT可以减少ox-LDL造成血管内皮细胞损伤形成的细胞碎片，通过CCK-8法检测细胞存活率发现DAPT能提高ox-LDL作用下HUVECs的存活率，由此验证了我们之前的推断，即在ox-LDL损伤HUVECs的模型中，DAPT可以起到保护细胞，减少细胞损伤的作用。

DAPT通过抑制γ-分泌酶使Notch受体胞内段(Notch intracellular domain，NICD)水解和释放，导致游离NICD减少，NICD对下游通路的激活减少，从而发挥效应[16]。在我们研究中，通过对蛋白Notch1、Notch4和Jagged1的检测发现，在ox-LDL与DAPT各自影响下，蛋白表达量增减完全相反，因此说明ox-LDL与DAPT在血管内皮细胞的Notch信号通路上影响是完全相反的。据Pedrosa 等[17]研究表明，Jagged1对于平衡体内血管内皮的生长和成熟具有重要作用，在伤口愈合过程中，Dll4/Notch1信号途径会抑制血管内皮的覆盖和血管生长，但这个过程又会激活Jagged1，Jagged1却可以通过Jagged1/Notch4信号途径抵消这种作用，促进内皮细胞成熟后血管生长，从而促进伤口愈合。结合我们实验结果，我们认为ox-LDL可能通过Dll4/Notch1信号途径使HUVECs损伤，同时会抑制具有平衡作用的Jagged1/Notch4信号途径，进一步加重细胞损伤，由于受体Notch4表达被抑制，使得相应配体Jagged1反馈性升高。同理，DAPT可以抑制Dll4/Notch1信号途径，减少细胞损伤，通过激活Jagged1/Notch4信号途径而使HUVECs增殖成熟，使损伤血管壁再内皮化。因此DAPT可以拮抗ox-LDL对血管内皮细胞的损伤，同时保护血管内皮细胞再生和成熟，对保护血管壁的完整性有重要意义。

对于Notch信号通路，仍存在许多机制尚未明确，可能在ox-LDL影响下，Notch信号通路的其它蛋白亦会发生不同改变。由于还存在不依赖经γ-分泌酶水解过程的非经典Notch信号通路，DAPT不能完全阻断Notch信号通路下游靶基因的表达，其它的配体受体通路发挥的作用有待进一步研究[18]。

总之，通过我们的研究可以得出以下结论： ox-LDL可以通过激活Notch信号通路使血管内皮细胞损伤，DAPT对血管内皮细胞具有保护作用，DAPT通过调控Notch信号通路拮抗ox-LDL对HUVECs造成的损伤。

(致谢：感谢厦门大学医学院大学生创新实验室；感谢厦门大学医学院机能学实验平台；感谢厦门大学医学院器官移植研究所李成林博士；感谢厦门大学公共卫生学院黄桢翔老师。)

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(责任编辑： 林白霜， 罗 森)

DAPT attenuates ox-LDL-induced human umbilical vein endothelial cell injury

REN Kai-xin, FAN Zi-xu, YOU Ru-chun, HAN Wei-min, ZHANG Ran, HUANG Rui, YAN Guo-liang, ZHANG Ye

(MedicalCollegeofXiamenUniversity,Xiamen361102,China.E-mail:zhangye@xmu.edu.cn； 79720905@qq.com)

AIM: To investigate the effect ofN-[N-(3,5-difluorophenacetyl)-L-alanyl]-S-phenylglycine t-butyl ester (DAPT) on the Notch signaling pathway in a model of oxidized low-density lipoprotein (ox-LDL)-induced human umbilical vein endothelial cell (HUVEC) damage. METHODS: HUVECs were divided into control group, ox-LDL group, DAPT group and ox-LDL+DAPT group. The morphological changes of the HUVECs with different treatments were observed under light microscope. The viability of the HUVECs was measured by CCK-8 assay. The protein expression levels of Notch1, Notch4 and Jagged1 were determined by Western blot. RESULTS: ox-LDL induced great damage to the HUVECs, evidenced by increased cell death and debris in the culture. However, the cell damage was abolished by adding DAPT into the culture. The viability of the HUVECs was increased by co-treatment with DAPT and ox-LDL. ox-LDL treatment significantly decreased the protein expression levels of Notch1 and Jagged1, and elevated Notch4. However, these changes were totally reversed by DAPT. None of these proteins showed significant change in the HUVECs co-treated with DAPT and ox-LDL as compared with control group.CONCLUSION: ox-LDL is able to induce HUVEC damageinvitro. DAPT attenuates ox-LDL-induced damage in the HUVECs by regulating the Notch signaling pathway.

HUVECs; Oxidized low-density lipoprotein; DAPT; Notch signaling pathway

1000- 4718(2017)06- 1125- 05

2016- 10- 17

2017- 03- 30

厦门大学校长基金本科生项目(No.CXB2014010)

R363.2+1

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.06.027

杂志网址： http://www.cjpp.net

△通讯作者 张 业 Tel: 0592-2188670； E-mail: zhangye@xmu.edu.cn； 闫国良 Tel: 0592-2187157； E-mail: 79720905@qq.com