bFGF和MMP9在鼻咽癌组织中的表达及其临床意义*

赵建夫， 陈文慧， 赵凤芝， 全 强， 樊 晶， 陈碧云， 张 鼎， 徐 萌

(暨南大学附属第一医院肿瘤科， 广东 广州 510632)

bFGF和MMP9在鼻咽癌组织中的表达及其临床意义*

赵建夫， 陈文慧， 赵凤芝， 全 强， 樊 晶， 陈碧云， 张 鼎， 徐 萌△

(暨南大学附属第一医院肿瘤科， 广东 广州 510632)

目的： 探讨碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和基质金属蛋白酶9(MMP9)在鼻咽癌患者中的表达及其临床意义。方法: 应用免疫组化方法检测289例鼻咽癌患者活检组织治疗前bFGF和MMP9的表达水平，并分析二者与鼻咽癌患者临床病理特征和预后的关系。结果: 289例鼻咽癌组织bFGF和MMP9阳性表达率分别为71.3%和61.6%；bFGF和MMP9的阳性表达与鼻咽癌的N分期和临床分期有显著的相关性(P<0.05)，且两者的高表达均与鼻咽癌的不良预后显著相关(P<0.01)；在鼻咽癌组织中Spearman相关分析发现，bFGF的表达与MMP9的表达呈明显正相关(r=0.634，P<0.05)；亚组分析表明，bFGF和MMP9表达水平均升高的鼻咽癌患者的预后最差。结论: bFGF和MMP9在鼻咽癌组织中的表达升高，且两者与鼻咽癌的不良预后明显相关，联合应用有可能成为鼻咽癌的诊断、治疗及判断预后的生物标志物。

鼻咽癌； 碱性成纤维细胞生长因子； 基质金属蛋白酶9； 预后； 生物标志物

鼻咽癌是我国华南地区常见的恶性肿瘤之一，其恶性程度较高，早期即可出现淋巴结转移[1-2]。放射治疗是鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma, NPC)最主要的治疗手段，随着影像学水平和放疗技术的提高，鼻咽癌的局部区域控制率得到明显的提高[3]，但远处转移率仍居高不下。因此，寻找鼻咽癌发生发展的重要靶向标志物，对肿瘤精准治疗及预后判断等具有重要的指导意义。

基质金属蛋白酶家族(matrix metalloproteinases, MMPs)为锌离子依赖性内肽酶超家族，其主要生理功能是降解细胞外基质的有效成分、参与调节细胞黏附、胚胎发育、组织再塑及创伤修复等[4-5]。MMP9是基质金属蛋白酶家族中重要的IV型胶原酶，在多种肿瘤中表达升高，并能通过促进肿瘤新生血管生成、细胞黏附等影响恶性肿瘤的增殖、迁移和侵袭[6-9]。碱性成纤维生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)是具有促进细胞有丝分裂和诱导新血管生成作用的多肽，在肿瘤侵袭和转移中均扮演重要角色[10-12]。因此，bFGF和MMP9在肿瘤侵袭转移中均扮演重要角色。目前国内外有关鼻咽癌发病和预后的相关研究越来越多，但是bFGF和MMP9两者联合应用在国内外鲜见报道。本研究通过检测鼻咽癌患者治疗前活检组织中bFGF和MMP9的表达情况，探讨两者与鼻咽癌的关系及在鼻咽癌发生发展中的作用，为鼻咽癌的诊断、治疗以及判断预后提供新思路和理论依据。

材 料 和 方 法

1 一般资料

搜集2005年1月～2008年12月在广州市暨南大学附属第一医院初治未发生远处转移的鼻咽癌患者组织标本289例，治疗前均通过鼻咽组织活检病理证实为非角化性鼻咽癌，所有鼻咽癌患者均于我院住院完成全程常规标准治疗，均有完整的临床及随访资料，排除如严重心、肝、肾疾病、血栓性疾病以及1个月内有手术史、创伤史及合并严重感染的患者。其中男性227例，女性62例；年龄18～77岁，中位年龄46岁。所有患者根据第七版美国癌症联合委员会/国际抗癌联盟(AJCC/UICC)的鼻咽癌TNM分期标准重新评定临床分期。本研究经本院伦理委员会批准，所有患者均签署知情同意书。

2 主要试剂

免抗人多克隆抗体 MMP9、兔抗人单克隆抗体bFGF均购自Abcam；免疫组织化学染色 SP 试剂盒及DAB显色试剂盒购自福州迈新生物技术开发公司。

3 免疫组化检测方法

所有标本均经4%中性甲醛固定，常规石蜡包埋。石蜡切片厚4 μm，并脱蜡、水化。具体方法按根据免疫组织化学染色SP试剂盒说明书进行操作，检测鼻咽癌组织中bFGF和MMP9蛋白的表达，PBS作为I抗的阴性对照。

4 结果评定

染色结果显示bFGF和MMP9均主要表达在鼻咽组织的细胞膜及细胞浆。选取5个高倍(×400)视野，每视野计数100个细胞，取其平均数，病理结果至少由两位独立的病理医生在不知病例资料的情况下完成。将免疫染色强度分为阴性(0分)、弱阳性(1分)、中度阳性(2分)和强阳性(3分)；染色范围百分比分为： < 25% (1 分)， 26%～50% (2 分)， 51%～75% (3 分)，> 75% (4分)。按照染色强度及阳性细胞数占肿瘤细胞的百分比综合计分：把染色强度得分与阳性细胞数得分相乘选择，0～4分判断为阴性，5～12分判断为阳性。

5 统计学分析

采用SPSS 17.0统计软件进行数据处理。采用Pearson chi-square test或Fisher’s exact test分析bFGF或MMP9的表达与临床资料(包括患者的年龄、性别、肿瘤分级、TNM 分期及临床分期)之间的联系；两组率的比较采用卡方检验；应用Spearman等级相关进行bFGF和MMP9表达的相关性分析；采用Kaplan-Meier法分析bFGF或MMP9的表达与预后的关系；采用log-rank检验对不同生存曲线进行比较；t检验或Mann-Whitney检验用于两组独立样本之间的比较分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 bFGF和MMP-9的表达与鼻咽癌各临床特征的关系

290例鼻咽癌患者的临床特征见表1，患者的中位随访时间为69个月(四分位数间距为62～73 月)，37例患者出现局部区域复发，47例患者发生远处转移，其中有6例患者同时出现有局部区域复发和远处转移，死亡患者54例。bFGF和MMP9染色均主要为细胞浆阳性，分布于肿瘤细胞的细胞浆呈棕黄色颗粒，见图1。

检测bFGF水平结果显示，289例鼻咽癌组织bFGF阳性表达率为71.3%，且bFGF蛋白的高表达与鼻咽癌的N分期和临床分期有显著的相关性(P<0.05)。另外， bFGF蛋白的表达与其它临床病理特征(包括年龄、性别、病理分级和T分期)没有明显的相关性，见表1。

检测MMP9水平结果显示，289例鼻咽癌组织MMP9阳性表达率分别为61.6%。MMP9蛋白的高表达与鼻咽癌的N分期和临床分期有显著的相关性(P<0.05)。另外， MMP9蛋白的表达与其它临床病理特征(包括年龄、性别、病理分级和T分期)没有明显的相关性，见表1。

*Chi-square test.

Figure 1.Expression of bFGF and MMP9 proteins in NPC tissues detected by immunohistochemical staining (×40 ).

图1 免疫组化染色检测bFGF和MMP9在鼻咽癌组织及癌旁正常鼻咽黏膜上皮组织中的表达

Spearman相关分析发现，bFGF的表达与MMP9的表达呈明显正相关(r=0.634,P<0.01)。

2 bFGF和MMP9在鼻咽癌组织中的表达与鼻咽癌患者预后密切相关

分析 bFGF和MMP9蛋白表达上调与鼻咽癌患者预后的关系，根据Kaplan-Meier生存分析制作生存曲线，用log-rank检验比较鼻咽癌患者存活时间的差异，结果见图2。bFGF和MMP9表达水平上调的鼻咽癌患者其疾病无进展生存率(progression-free survival, PFS)和总生存率(overall survival, OS) 明显短于那些表达水平低的患者(P<0.01)。

3 bFGF和MMP9联合表达与鼻咽癌预后的相关性

前面相关分析发现，bFGF表达水平和MMP9表达水平在鼻咽癌患者中均升高，且bFGF的表达与MMP9的表达呈明显的正相关，进一步分析发现bFGF和MMP9两者表达都上调的鼻咽癌患者比bFGF和(或)MMP9两者表达较低的鼻咽癌患者预后差。结果显示，bFGF和MMP-2在鼻咽癌组织中的表达升高，且与鼻咽癌患者预后差密切相关，见图2。

Figure 2.Kaplan-Meier curves of progression-free survival (A, C, E) and overall survival (B, D, F) in nasopharyngeal carcinoma patients with different expression levels of bFGF (A, B), MMP9 (C, D) and both (E, F).

图2 鼻咽癌组织中 bFGF和 MMP9 的表达及与鼻咽癌预后的关系

讨 论

鼻咽癌发病具有明显的地域性，以我国华南地区发病率最高，尤其是我国的广西、 广东、 福建等地高发，发病率可达 33/10 万，鼻咽癌又被称为“广东瘤”[13-14]。近年来鼻咽癌的治疗方案不断改善，但患者总体5年生存率仍不理想，主要原因是肿瘤出现局部复发或/和远处转移，其最常见的转移部位是骨、肝和肺[1, 15]。因而寻找肿瘤侵袭和转移的特异性标志物将有助于判断鼻咽癌患者的预后，并对有复发倾向的患者采取更有效的治疗措施，以提高患者生存率。

近年研究表明，血管形成在肿瘤的发生、发展、侵袭及转移中发挥着重要作用，已成为肿瘤治疗的新靶点之一[16]。bFGF是目前已知最重要的血管新生正调控因子之一，在多种恶性肿瘤疾病中表达升高，可反映微血管增生程度[17]。bFGF是内皮细胞生长促进作用效果最强的因子之一，主要机制是bFGF调节细胞外分子，包括胶原酶、蛋白激酶、整合素等的活性，促进肿瘤中新生血管形成，从而促进肿瘤细胞浸润和转移[18]。Dietz等[19]研究发现放化疗对头颈癌患者的疗效与血清中bFGF的浓度密切相关，血清中bFGF的浓度越低，疗效越好。叶奕菁等[20]认为bFGF在鼻咽癌组织中有高表达,参与了鼻咽癌发生发展、侵袭转移等生物学行为。赵建夫等[21]发现bFGF在鼻咽癌组织中的表达升高，且与肿瘤的放疗敏感性明显相关，可作为预测鼻咽癌放疗敏感性的重要指标。Yang等[22]检测正常人和肿瘤患者尿液和血清中的bFGF浓度的差异进一步证明肿瘤血管增殖与bFGF蛋白的表达有密切关系，并指出bFGF蛋白表达是诊断血管瘤的蛋白标志物。我们收集了 289例鼻咽癌活检组织标本，免疫组化结果发现，在鼻咽癌组织中bFGF蛋白表达明显增高，且与鼻咽癌的N分期和临床分期有显著的相关性，提示在鼻咽癌中bFGF高表达可能与肿瘤恶性进展的程度密切相关。根据Kaplan-Meier生存曲线分析，结果显示bFGF高表达与鼻咽癌不良预后密切相关。

MMPs是一组结构和功能相关的锌依赖性内肽酶，是能降解细胞外基质的蛋白酶，其高表达与人类肿瘤的转移潜能增加有关。MMP9是MMPs家族中最重要的一员，与肿瘤的高侵袭性相关[23-24]。Cheng等[25]研究发现MMP9表达水平上调的鼻咽癌患者无病生存率和总生存率明显低于那些表达水平低的患者。

本研究结果示，在鼻咽癌组织中MMP9蛋白表达明显增高，且与鼻咽癌的N分期和临床分期有显著的相关性，提示在鼻咽癌中MMP9高表达可能与肿瘤恶性进展的程度密切相关。预后分析评估结果显示，MMP9高表达与鼻咽癌不良预后密切相关。

肿瘤转移和/或扩散不仅需要新生血管，也需要降解细胞外基质(extracellular matrix, ECM)蛋白。Mohan等[26]发现，MMP9是bFGF介导血管生成通路的下游靶基因，bFGF通过活化AP-1调节MMP9表达，并通过姜黄素抑制MMP9的启动子活性而阻断bFGF介导的血管生成及MMP9表达，提示bFGF和MMP9在血管生成过程中的相关性。在鼻咽癌组织中Spearman相关分析发现，bFGF的表达与MMP9的表达呈明显正相关。进一步分析发现bFGF和MMP9两者表达都上调的鼻咽癌患者比bFGF和(或)MMP9两者表达下降的鼻咽癌患者预后最差。结果显示，bFGF和MMP-2在鼻咽癌组织中的表达升高，且与鼻咽癌患者预后差密切相关。

综上所述，bFGF和MMP9在鼻咽癌组织中表达升高，且与鼻咽癌的不良预后显著相关。鼻咽癌患者治疗前bFGF和MMP9的表达水平可能成为鼻咽癌精准治疗新的潜在的治疗靶点及预后判断等提供新的依据。

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(责任编辑： 陈妙玲， 罗 森)

Expression and clinical significance of bFGF and MMP9 in nasopharyn-geal carcinoma

ZHAO Jian-fu, CHEN Wen-hui, ZHAO Feng-zhi, QUAN Qiang, FAN Jing, CHEN Bi-yun, ZHANG Ding, XU Meng

(TheFirstAffiliatedHospitalofJinanUniversity,Guangzhou510632,China.E-mail:xumengjinan@yahoo.com)

AIM: To detect the expression of basic fibroblast growth factor (bFGF) and matrix metalloprotei-nase 9 (MMP9) in nasopharyngeal carcinoma (NPC) and its correlation with clinicopathological features and prognosis of the patients. METHODS: The expression of bFGF and MMP9 was detected by the method of SP immunohistochemical staining in biopsy tissues of NPC patients. The relationship between the expression and the clinical significance was analyzed as well. RESULTS: In 289 cases of NPC patients, the positive rates of bFGF and MMP9 were 71.3% and 61.6%, respectively. Correlation analysis demonstrated that the expression rates of bFGF and MMP9 were both positively associated with N stage and clinical stage in NPC patients. The high expression rates of both bFGF and MMP9 were associated with poor overall survival and progression-free survival of NPC patients. Furthermore, the positive rate of bFGF was positively correlated with that of MMP9, and over-expression of both bFGF and MMP9 was correlated with the poorest survival outcomes in NPC patients. CONCLUSION: bFGF and MMP9 are over-expressed in NPC tissues and significantly associated with NPC recurrence and poor outcome. The combined interpretation of bFGF and MMP9 expression levels leads to refinement of the risks for the NPC patients and could be chosen as the prognostic biomarkers.

Nasopharyngeal carcinoma; Basic fibroblast growth factor; Matrix metalloproteinase 9; Prognosis; Biomarkers

1000- 4718(2017)06- 1006- 06

2016- 12- 29

2017- 04- 10

国家自然科学基金资助项目(No. 81273814)； 广东省重大新药创制重大科技专项资助(No. 2013A022100031); 暨南大学附属第一医院科研培育项目

R730.23; R739.63

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.06.008

杂志网址： http://www.cjpp.net

△通讯作者 Tel： 020-38688910; E-mail: xumengjinan@yahoo.com