水飞蓟宾抑制肝癌细胞HepG2增殖和迁移能力

赵逸飞，万静，戴芸

（武汉大学医学院附属中南医院内科，武汉 430071）

水飞蓟宾抑制肝癌细胞HepG2增殖和迁移能力

赵逸飞，万静，戴芸#*

（武汉大学医学院附属中南医院内科，武汉 430071）

目的探讨水飞蓟宾对肝癌细胞生长、增殖和迁移能力的影响。方法用含不同浓度水飞蓟宾的培养基孵育HepG2细胞后，采用倒置显微镜观察细胞形态，应用MTT法、EdU掺入实验和细胞克隆形成实验法检测细胞增殖能力，应用细胞划痕试验分析水飞蓟宾对HepG2迁移能力的影响。结果用不同浓度水飞蓟宾刺激HepG2细胞后，倒置显微镜镜检显示：水飞蓟宾刺激使细胞数目减少，胞体皱缩变小，高浓度刺激时出现较多的死亡细胞。MTT分析、EdU增殖实验和克隆形成实验显示：水飞蓟宾刺激使细胞增殖能力显著降低，细胞的克隆形成数显著减少。细胞划痕试验结果显示：水飞蓟宾对HepG2细胞的迁移爬行能力也产生明显抑制作用。结论水飞蓟宾能抑制HepG2细胞的增殖和迁移能力，这可能是其发挥抗肿瘤作用的机制之一。

水飞蓟宾；肝癌细胞HepG2；增殖；迁移

水飞蓟素（silymarin，SM）是从植物水飞蓟（silybum marianum）中提取的一种黄酮类抗氧化剂。在水飞蓟素的各组分中水飞蓟宾（silibinin，SB）含量最多，生物活性也最强，其分子式见图1。水飞蓟宾具有抗脂质过氧化、清除自由基、维持细胞膜稳定性、促进肝细胞再生及降血脂等作用，具有较强的肝脏保护作用，临床上常用来治疗肝纤维化、乙醇相关性肝病[1]。近年来的研究发现，水飞蓟宾可以通过诱导肿瘤细胞周期阻滞和凋亡、抑制新生血管生成等机制，抑制多种肿瘤细胞的增殖作用[2,3]，但目前对其抗肿瘤的机制尚无统一认识。为探讨水飞蓟宾对肝癌细胞增殖和迁移力的影响，我们对水飞蓟宾在人肝癌细胞系HepG2的作用进行了初步研究，探讨其抑制肿瘤细胞的可能机制及其应用前景。

图1 水飞蓟宾的分子式Fig.1 Chemical structure of silybinin

材料与方法

1 细胞培养和传代

人肝癌细胞系HepG2细胞由武汉大学附属中南医院医学科学研究中心保存提供。采用高糖型DMEM培养基（含10%胎牛血清，1%青霉素和1%链霉素）在37℃、含5% CO2 的培养箱中培养。待培养瓶中的细胞密度接近80%时，用磷酸盐缓冲液（PBS，pH7.4）洗涤细胞两次，再加入胰酶消化细胞。将消化好的细胞分加到新的培养瓶中，以1∶3比例传代培养。DMEM培养基购于GIBCO公司；胎牛血清购于杭州四季青生物工程有限公司。

2 试剂

水飞蓟宾 (silibinin，MW482.44)、四甲基偶氮唑蓝（MTT）和二甲基亚砜（DMSO）购自Sigma公司。水飞蓟宾用DMSO配制成150μmol/L储存液，-20℃冷冻保存。使用时按需要用DMEM培养基配制成工作浓度。EdU（5-ethynyl-2’-deoxyuridine）试剂盒购自广州锐博生物科技有限公司。

3 细胞增殖检测

首先，采用MTT法测定水飞蓟宾对HepG2细胞增殖的影响。培养HepG2细胞至对数生长期，常规消化计数，调整细胞浓度至2×104个/ml，然后将细胞接种于96孔板中，每孔100μl细胞悬液，置于细胞培养箱中培养过夜。加入不同浓度水飞蓟宾的细胞培养基100μl。设立阴性对照组（仅含DMSO），空白对照组（仅加入培养基），每组5个重复孔，继续培养24h和48h。每天观察细胞增殖情况，最后每孔加入20μl 的MTT（5mg/ml），37℃继续培养4 h，弃掉培养液，每孔加入150μl DMSO，置于摇床上室温振荡10min，使紫色沉淀物完全溶解，用酶标仪测定490nm处的光吸收值，参考波长为630nm, 分别绘制增殖曲线，并计算IC50值。实验重复3次。

另外，采用EdU细胞增殖实验检测细胞的增殖情况。取对数生长期细胞，以每孔 2×103细胞接种于96孔板中，培养至次日。加入不同浓度SM的细胞培养基100µL，设立阴性对照组（仅含DMSO），空白对照组（仅加入培养基），每组5个重复孔，继续培养48h。按照EdU试剂盒说明书提供的方法进行荧光染色操作，用细胞培养基按1∶1000的比例稀释EdU溶液加入培养板中孵育2h。细胞固定后，采用1× Apollo®染色反应液孵育30min。最后采用Hoechst33342复染细胞核。于倒置荧光显微镜下观测拍照。同一视野中，EdU掺入的细胞核在505nm波长激发光下发出红色荧光，无EdU掺入的细胞核只能在400nm波长激发光下散发蓝色荧光。每个孔内随机选取5个区域记录，使用Image J软件将同一视野下的图片叠加，计算增殖细胞比例。红色荧光细胞占总细胞数的百分比代表细胞增殖能力。

4 细胞克隆形成实验

取对数生长期HepG2细胞，接种100个细胞/孔于6孔板，分别采用含终浓度0, 25, 50 μmol/L的水飞蓟宾培养基作用于细胞，并设立阴性对照组（培养基仅加DMSO），每组细胞设立3个复孔，常规培养2～3周，待形成肉眼可见细胞集落时终止实验。4%多聚甲醛固定细胞后，结晶紫染色，显微镜下计数＞50个细胞的克隆数。

5 细胞迁移实验

HepG2细胞按1×105个/孔接种于24孔板内，常规培养至每孔细胞到达100%丰度。用灭菌的200µl tip头垂直划线，用PBS缓冲液清洗去悬浮细胞，重新加入1%胎牛血清和不同浓度的水飞蓟宾的DMEM培养基，继续培养24h，用4%多聚甲醛固定细胞，0.1%结晶紫染色。用倒置显微镜观察并记录测量细胞划痕间距，每个孔内随机选取5个区域记录并测量，每组实验重复3次。

6 统计学分析

实验数据用均数±标准差（¯x ± s）表示。比较两组之间的均值用t 检验，P ＜0.05 表示有统计学差异。

结 果

1 水飞蓟宾抑制HepG2细胞增殖

用终浓度分别为0、25、50、100μmol/L的水飞蓟宾作用HepG2细胞48h后，倒置显微镜观察可见随着浓度的增加，细胞数目明显减少，细胞形态异常，细胞形态表现为变圆、变皱缩；死亡细胞逐渐增多，细胞的生长明显受到抑制。而空白对照组的细胞生长良好，随着培养时间的延长，细胞数目和细胞密度逐渐增加（图2）。

MTT法检测显示水飞蓟宾对HepG2细胞系的增殖有显著抑制作用，在24h和48h内随着水飞蓟宾浓度的增加，其抑制HepG2细胞生长作用逐渐增强（图3）。24h内水飞蓟宾的半数抑制浓度（IC50）为41.52μmol/L，48h的半数抑制浓度（IC50）为34.20μmol/L（图3）。同时，采用EdU掺入实验检测水飞蓟宾对细胞的增殖能力的作用。结果表明，不同浓度的水飞蓟宾对细胞的增殖均有抑制作用，水飞蓟宾的浓度和细胞的增殖抑制效应之间存在量效关系，其中对照组（仅加DMSO）细胞增殖率为（57.6±7.2）%，25μmol/L组细胞增殖率为（41.2±6.2）%，50μmol/L组增殖率为（28.2±4.2）%（图4）。

2 水飞蓟宾抑制HepG2细胞的克隆形成

克隆形成实验结果显示，水飞蓟宾对HepG2细胞的克隆形成有明显的抑制作用。采用不同浓度SM作用于细胞2周后，其中空白对照组（仅加DMSO）为（124.5±11.2）个，25μmol/L组细胞集落形成数为（77.5±5.7）个，50μmol/L组空白对照组为（27.3±4.9）个，与对照组相比均存在显著性差异；水飞蓟宾处理组的细胞形成的细胞集落较小，细胞数较少（图5）。

图2 不同浓度水飞蓟宾作用于HepG2细胞后形态学观察。 A，对照组；B，25μmol/L组； C，50μmol/L组；D，100μmol/L组；比例尺，100μmFig. 2 The Morphological change of HepG2 cells treated with silibinin of diferent concentrations. A, control; B, 25μmol/L silibinin; C, 50μmol/L silibinin; D, 100μmol/L silibinin; scale bar, 100μm

图3 MTT法检测水飞蓟宾对HepG2细胞增殖的影响Fig. 3 The efect of silibinin on the proliferation of HepG2 cells detected by MTT assay

图4 EdU掺入实验检测水飞蓟宾对HepG2细胞增殖的影响。比例尺，50μmFig. 4 The efect of silibinin on the proliferation of HepG2 cells detected by EdU assay. Scale bar, 50μm

3 水飞蓟宾抑制HepG2细胞的迁移

细胞划痕实验结果显示，水飞蓟宾对HepG2细胞的爬行迁移能力具有明显抑制作用，经过24h后，25μmol/L和50μmol/L 水飞蓟宾组的细胞迁移距离明显小于阴性对照组细胞（图6）。

讨 论

图5 水飞蓟宾对HepG2细胞克隆形成的影响Fig. 5 The efect of silibinin on the formation of HepG2 colonies

图6 水飞蓟宾对HepG2细胞迁移的影响。A，细胞划痕实验检测细胞迁移；B，迁移率统计分析；*，0.01＜P ＜ 0.05；**，P ＜ 0.01；比例尺，200μmFig. 6 The efect of silibinin on the migration of HepG2 cells. A, scratch assay detection of cell migration; B, statistical analysis of the migration rate; *, 0.01＜P＜0.05; **, P＜0.01; scale bar, 200μm

水飞蓟素是从菊科植物水飞蓟、乳蓟、朝鲜蓟等中提取的黄酮类化合物，商品名为益肝灵、水林佳等。其中水飞蓟宾为其最主要的生物活性成分，临床上主要用于治疗急、慢性肝炎、肝硬化及肝损伤，实践证明水飞蓟宾对肝损害具有一定的治疗作用，对正常组织器官无明显毒副作用并显示良好的耐受性及极低的副作用[4,5]。近年来随着水飞蓟宾药理学研究的不断深入，其抗肿瘤作用日益引起人们的关注。人们发现水飞蓟素具有抗肿瘤作用。水飞蓟宾对各种上皮来源的肿瘤如肺癌、前列腺癌、结肠癌、膀胱癌等均具有明显抑制作用；而且水飞蓟宾已进入治疗前列腺癌的I期临床试验研究[6-8]。

本研究通过分析水飞蓟宾对肝癌细胞系HepG2的生物行为的影响，探讨了水飞蓟宾对埃细胞的生长和迁移等行为的抑制作用。研究表明，水飞蓟宾可以明显抑制HepG2细胞的增殖，其药效和药代动力学表现出较为明显的药物浓度与时间依赖效应。水飞蓟宾的半数抑制浓度(IC50)为30～40μmol/L。HepG2细胞的生长和细胞形态与对照组细胞比较，存在明显差异。同时，在细胞克隆形成试验中也发现，水飞蓟宾具有明显的抑制作用，与对照组比较发现，水飞蓟宾处理组形成的细胞集落较小，细胞数也较少。应用细胞划痕试验分析HepG2细胞的爬行能力时发现，水飞蓟宾可以抑制HepG2细胞的迁移，而且较高浓度的SB组抑制作用更为明显。我们的实验结果提示，水飞蓟宾对肝癌细胞具有较为明显的生长和迁移能力的抑制作用。这一结果不仅为水飞蓟宾的癌症临床治疗提供了实验依据，也进一步拓展了其药理用途及研究价值。

[1] 王红军，姜媛媛，路平，等. 水飞蓟宾的抗肿瘤、抗氧化和免疫调节分子药理学机制研究进展. 药学学报，2010，45（4）:413−421.

[2] 刘志刚，李雪玲，翁立冬，等. 水飞蓟素药理作用研究进展. 辽宁中医药大学学报, 2012,（10）∶ 91-93.

[3] 鲁小梅，王盛，刘瑞江，等. 水飞蓟素抗肿瘤作用及其机制研究进展. 中国药理学与毒理学杂志，2009，23（4）：320-324.

[4] 刘学民. 水飞蓟素治疗150例慢性肝炎的疗效分析. 中国医药指南，2013，11（19）∶141-142.

[5] 郭斯敏，谢青. 水飞蓟素在慢性肝炎治疗中的新认识及研究进展. 肝脏，2013，18（6）∶423-426.

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[7] Singh RP，Tyagi A, Sharma G，et al．Oral silibinin inhibits in vivo human bladder tumor xenograf growth involving down-regulation of survivin．Clin Cancer Res, 2008, 14(1)∶ 300-308．

[8] Sharma G，Singh RP，Chart DC，Agarwal R．Silibinin induces growth inhibition and apoptotic cell death in human lung carcinoma cells．Anticancer Res, 2003, 23(3B):2649-2655．

Silibinin inhibits the proliferation and migration of HepG2 hepatic cancer cells

Zhao Yifei, Wan Jing, Dai Yun#*
（Department of Cardiology, Zhongnan Hospital of Wuhan University, Wuhan 430071, China）

ObjectiveTo investigate the efect of silibinin on the growth, proliferation and migration of hepatic cancer cells.MethodsHepG2 hepatic cancer cells were cultured in media containing silibinin of diferent concentrations. The morphological change of the cells was observed by inverted microscope. The proliferation of the cells was examined by the methyl thiazol tetrazolium (MTT) assay, EdU incorporation assay and colony formation assay; the migration was observed by the scratch test.ResultsThe cells treated with silibinin shrunk and decreased in number. A number of dead cells were observed in the high concentration groups. The MTT, EdU and colony formation assays indicated that silibinin treatment signifcantly inhibited the proliferative capacity of the cells as well as colony formation. The scratch test showed remarkable inhibitory efect of silibinin on HepG2 cell migration. Conclusion Silibinin can inhibit the proliferation and migration of HepG2 cells, and this might be part of its anti-tumor mechanism.

Silibinin; HepG2 hepatic cancer cell; cell proliferation; migration

R73-36

A

10.16705/ j. cnki. 1004-1850.2017.02.008

2016-11-22

2017-01-20

赵逸飞，男（1999年），汉族，湖北省武汉市水果湖高级中学高中生

#湖北省武汉市水果湖高级中学化学教师，水果湖高中科学创新实践活动指导老师

*通讯作者(To whom correspondence should be addressed)：1416070116@qq.com