人乳头瘤病毒感染与喉鳞状细胞癌发生及预后的关系

刘丹凌 徐雅男 王家东



·临床研究·

人乳头瘤病毒感染与喉鳞状细胞癌发生及预后的关系

刘丹凌 徐雅男 王家东

目的 探讨人乳头瘤病毒(HPV)与喉鳞状细胞癌(LSCC)发生的关系以及HPV对LSCC患者预后的影响。方法 回顾分析2004～2013年在本科就诊的252例LSCC患者的临床资料。所有手术标本为4 μm厚切片，通过P16免疫组织化学染色及荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测HPV的阳性率及分型。p16及HPV DNA同时阳性时认为HPV感染阳性。采用Kaplan-Meier法统计252例LSCC患者的总生存率及HPV阳性率对患者生存率的影响。结果 252例LSCC患者的P16阳性率为7.1%(18/252)， HPV DNA的阳性率为6.0%(15/252)，其中14例为HPV-16感染(93.3%)，1例为HPV-18感染(6.7%)。252例LSCC患者的3年总生存率为67.0%，HPV DNA阳性患者的3年生存率为77.0%，HPV阴性患者的3年生存率为65.0% (P=0.25)。结论 中国LSCC人群中HPV的阳性率较低。HPV感染与LSCC患者的预后无显著关系。(中国眼耳鼻喉科杂志，2017，17：170-175)

肿瘤，鳞状细胞，喉；P16蛋白；乳头瘤病毒,人；生存率

头颈部肿瘤是全球第6大常见肿瘤，其中喉癌高居发病第2位，且95%为鳞状细胞癌[1-2]。以往研究[3]认为吸烟与饮酒是导致喉鳞状细胞癌(laryngeal squamous cell carcinoma , LSCC)的主要因素，但近年来国外文献[2,4]报道合并人乳头瘤病毒(human papillomavirus, HPV)感染且无吸烟及饮酒史LSCC患病数量呈上升趋势。在HPV感染介导的LSCC发生过程中，HPV的DNA整合入宿主细胞基因后，通过E6、E7癌基因编码的癌蛋白干扰P53及视网膜母细胞蛋白(protein-retinoblastoma, pRb)通路的正常功能，表现为P53野生型及P16蛋白表达特异性上调；而其他原因如吸烟、饮酒引起的LSCC则表现为P53突变型及P16蛋白表达特异性下调[3,5]。因此可以通过P16蛋白初步筛查LSCC患者HPV的感染率[5-7]，在此基础上联合荧光定量聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)检测HPV DNA的方法，明确受试者的HPV感染状态[8]。HPV的感染状态对于头颈部鳞状细胞癌(head and neck squamous cell carcinoma, HNSCC)患者的预后影响差异很大。多项研究报道了HPV阳性的口咽部鳞状细胞癌(oropharyngeal, OPSCC)患者预后较阴性患者更好[9-12]，而HPV感染对非口咽鳞状细胞癌患者(non- oropharyngeal, NPSCC)预后的影响目前尚无明确定论[13-14]。本研究旨在通过检测P16蛋白的表达结合HPV DNA荧光定量PCR检测，分析LSCC患者中HPV的感染率，探究HPV与LSCC发生的关系。Kaplan-Meier法统计患者生存率，评估HPV感染与LSCC患者预后的关系。

1 资料与方法

1.1 临床资料 本研究纳入2004年1月～2013年12月就诊于本科并接受手术治疗的252例LSCC患者。患者均符合以下入组标准：术前未经放疗或化疗，大体标本满足P16蛋白的免疫组织化学染色及行PCR法检测HPV DNA的要求，并能长期在本科随访；由于目前生殖道HPV感染和LSCC中HPV感染的关系尚不明确，在考虑减少实验的干扰因素以及参考他人OPSCC实验基础上[15]，排除合并妇科HPV感染的患者。

252例LSCC患者中，男性244例、女性8例；年龄41～89岁，平均62.5岁。252例LSCC患者的所有临床数据均可在本院的电子病历系统中查证。根据美国癌症联合委员会(American Joint Committee on Cancer, AJCC)的分类系统对肿瘤进行TNM分期。具体TNM分期情况见表1。本研究剔除了术前已经发生远处转移的患者。本实验通过上海交通大学医学院附属仁济医院伦理委员会批准并取得受试患者的知情同意。

电子病历系统中记录患者的烟酒史。吸烟者定义为个人每周至少吸香烟、烟斗、雪茄或其他烟草制品，并持续1年以上[16]。饮酒者定义为个人每月至少饮用170 g白酒、340 g啤酒或42.5 g烈酒，并持续1年以上[4]。

表1 252例LSCC患者的临床TNM分期(n)

每位患者一块10%甲醛(福尔马林)固定石蜡包埋的肿瘤蜡块，组织切片并行苏木素-伊红染色(hematoxylin-eosin staining, HE)。2位病理科医师分别对HE切片进行读片，并诊断这些蜡块为LSCC。

1.2 治疗方法 患者接受常规的手术治疗，且在术前未接受放疗或化疗。原发灶为T3期或者颈部淋巴结转移为N2期的患者术后接受放疗，原发灶为T4期或切缘阳性患者术后接受放疗的同时行顺铂和多烯紫杉醇(商品名：泰素帝)联合化疗。T1、T2、N0、N1期患者术后长期随访且无进一步治疗(图1)。患者的治疗方式与HPV感染状态无关，因为HPV感染检查不是我科对这类患者的术前常规检查项目。

图1. 喉癌患者接受的治疗

1.3 P16免疫组织化学法检测HPV感染 将患者手术时所取的组织蜡块切4 μm的薄片。P16免疫组织化学检测使用专用的试剂盒(CINtec P16 Histology，mtm laboratories，Roch)在Benchmark XT(Roche)上按照说明书操作。使用标准化P16阳性的OPSCC切片作为阳性对照，不加一抗的染色切片作为阴性对照。P16免疫组织化学阳性的判断标准采用罗氏公司该试剂应用的通用标准：恶性肿瘤细胞核与细胞质中超过70%的细胞存在弥漫性深褐色染色为阳性，其他染色都判断为阴性[2, 15]。另有2名资深头颈部肿瘤病理学专家分别对该免疫组织化学染色结果进行判读。

1.4 DNA抽提及荧光定量PCR检测 上述石蜡包埋的肿瘤蜡块每块切取2 μm的薄片10片，切片时注意避免不同蜡块间的交叉污染。使用Qiagen FFPE试剂盒(Hilden, 德国)，根据试剂盒说明书按步骤提取DNA。提取后使用NanoDrop测定DNA的纯度和浓度，并将合格的DNA样本保存在-20 ℃。使用HPV 16/18 亚型核酸扩增荧光检测试剂盒(Qiagen，德国)进行定量PCR检测：按试剂盒操作说明，在PCR反应液40 μL中，分别加入HPV 16 与HPV 18的引物[17]和2.5 μL的Taq酶。充分混匀后加入RT-PCR专用八连管中，每份加入处理后的组织DNA 2 μL 或试剂盒提供的标准品，放入全自动荧光定量PCR仪中，按照使用说明进入循环程序；95 ℃酶活化15 min，95 ℃变性1 min，初始50 ℃进行线性降温，每个循环下降0.5～40 ℃，最后72 ℃延伸1 min。阴性对照及阳性对照由试剂盒提供。利用IQ5分析软件，计算每份DNA的拷贝数。

1.5 随访 252例患者治疗完成后前3年内每3个月随访1次，第4年起每6个月随访1次，第6年起每12个月随访1次。随访内容包括：纤维喉镜或电子喉镜检查及影像学检查[CT、磁共振成像(magnetic resonance imaging, MRI)、正电子发射型计算机断层显像(positron emission computed tomography,PET)、胸部X线片、肝脏超声等]评估治疗情况。随访过程中，当颈部或肝脏超声怀疑有肿瘤转移可能或喉镜检查发现新生物时，再行CT、MRI及PET检查。术后复发及并发症没有包含在本研究的统计范畴内，本研究仅统计总体生存情况。

1.6 统计学处理 运用SPSS 22.0软件进行统计分析，对数据进行统计描述。分类变量采用卡方检验或Fisher确切概率法，双侧检验P<0.05认为差异具有统计学意义。Kaplan-Meier法统计生存率，存活患者计算从治疗结束到最后1次随访的生存时间，已死亡患者计算从治疗结束到死亡的时间。

2 结果

2.1 P16及HPV DNA的阳性率 252例LSCC患者中，P16阳性率为7.1%(18/252),HPV DNA的阳性率为6.0% (15/252)。15例HPV DNA阳性患者中，14例(93.3%)为HPV 16阳性，1例(6.7%)为HPV 18阳性。统计发现，患者的吸烟、饮酒情况，肿瘤部位以及淋巴结转移情况与P16的表达无显著相关(P>0.05)，与HPV DNA的表达无显著相关(P>0.05)(表2)。LSCC患者P16染色情况见图2。

表2 252例LSCC患者的临床特征[n(%)]

图2. LSCC患者的p16染色情况 A.LSCC p16阳性：恶性肿瘤的细胞核和细胞质中超过70%的细胞存在弥漫性深褐色染色；B.LSCC p16阴性：低于70%的恶性肿瘤细胞核与细胞质存在弥漫性深褐色染色(×100)

2.2 P16、HPV DNA表达与LSCC患者的预后 252例LSCC患者的平均随访时间为42.7个月(3～113个月)。198例患者存活，平均随访47.3个月(6～113个月)；54例患者死亡，平均随访25.9个月(3～80个月)。3年总生存率为67.0%(图3、表3)。

图3. LSCC患者3年的总生存率

表3 LSCC患者3年生存情况

18例P16阳性患者术后3年的总生存率为80%，平均生存时间为54.7个月。234例P16阴性患者术后3年的总生存率为65%，平均生存时间为41.8个月。2组的生存率差异无统计学意义(P=0.11)(图4、表4)。

图4. P16阳性和阴性2组患者生存曲线

表4 P16阳性和阴性LSCC患者生存情况

15例HPV DNA阳性患者术后3年的总生存率为77%，平均生存时间为56.3个月。237例HPV DNA阴性患者术后3年的总生存率为65%，平均生存时间为41.9个月。2组的生存率差异无统计学意义(P=0.25)(图5、表5)。

图5. HPV DNA阳性和阴性 2组患者生存曲线

表5 HPV DNA阳性和阴性患者生存情况

3 讨论

P16蛋白表达升高是HPV感染后一个特征性的指标[18]，这种现象是由于HPV的E7癌蛋白与pRb结合，导致pRb/E2F复合体解离，P16与“cyclin Dl-CDK4/CDK6”形成的复合体无法通过作用于pRb/E2F复合体抑制细胞增殖而出现过表达。在参考宫颈癌P16临床筛查[19-20]的基础上，本实验将标准化的P16免疫组织化学染色作为临床大样本检测LSCC患者HPV感染的初筛实验，取得较好的结果：敏感度为100%，特异度为83.3%。这和Xu等[7]和Venuti等[8]报道P16免疫组织化学法检测HNSCC中HPV感染敏感度可达100%，特异度为65%～79%的情况相符合。说明标准化的P16免疫组织化学作为HNSCC患者HPV的初筛实验具有较好的临床可行性。同时在P16免疫组织化学的基础上联合PCR荧光定量法HPV DNA分型检测，说明HPV感染后进入宿主细胞并产生活性蛋白质产物，从而进一步明确患者的HPV感染情况。相较于HPV检测的金标准：即在新鲜或冷冻组织中发现HPV E6/E7的mRNA[8, 21]，具有经济便利的特点，并且能更好地用于回顾性研究[6-8]。本实验中HPV DNA主要检测HPV 16和HPV 18，这2种类型都属于高危型HPV(指HPV持续感染与宫颈癌及外生殖器癌变关系密切的HPV类型)，特别是HPV 16，在HPV相关的OPSCC中感染率可达95%[2]，所以本实验主要进行这2型HPV的检测。这也是本实验的局限之处，所以下一步我们将在扩大样本量的同时，检测其他类型HPV的感染情况。

LSCC患者中HPV感染率差异很大(<3.8%～28%)[22-24]。本实验中252例LSCC患者P16的阳性率为7.2%，HPV的感染率仅为6.0%。较低感染率可能由以下因素导致。首先，HPV感染存在种族差异。Schabath等[25]对不同种族男性HPV(特别是高危型HPV感染)感染率的研究发现，亚洲人种或太平洋岛屿人种的感染率为18.7%，混血人种为20.8%，白种人为25.1%，黑种人为25.4%。因为本实验中的纳入对象均为中国籍亚洲人种，LSCC患者中HPV感染率较低和这种现象相符。其次，HPV的感染率存在地域差异。相对于美国2项研究[23,26]报道LSCC人群中HPV较高的感染率(23.7%和24.0%)，本实验中HPV的感染率较低，和法国与德国进行的几项研究[22,24]报道的HPV感染率较接近(<3.8%和5.0%)。再次，HPV感染情况在不同部位的HNSCC中差异很大，HPV感染与扁桃体癌关系最强(OR：15.1，95% CI:6.8～33.7)，其次是OPSCC (OR:4.3，95% CI:2.1～8.9)，最弱的是口腔鳞状细胞癌(oral cavity squamous cell carcinoma, OCSCC) (OR:2.0，95% CI:1.2～3.4)及LSCC(OR:2.0，95% CI:1.0～4.2)[27]。本实验结果和上述情况较为符合，说明HPV感染具有一定的组织倾向性，这需要进一步的实验探究。但综合以上内容可以认为中国LSCC人群中HPV的感染率较低。

由于HPV感染阳性的HNSCC发生机制主要依赖于癌基因E6和E7作用的pRb这一单一通路；而HPV感染阴性的HNSCC存在更多的基因突变，意味着更多信号通路的改变使其预后相对更差[3]。因此Leemans等[3]在分子水平认为HPV感染阳性的HNSCC患者预后较好。然而，在临床随访中不同HNSCC合并HPV感染的预后差异很大。HPV感染阳性的OPSCC患者较HPV感染阴性的患者预后更好。Fakhry等[28]在96例OPSCC患者的前瞻性研究中报道了HPV阳性患者2年总体生存率和无瘤生存率均优于HPV阴性患者。Rischin等[10]在一项对185例OPSCC患者的回顾性研究中同样发现HPV阳性患者生存更佳。而在NPSCC患者，HPV感染状态和预后并无显著相关。Chung等[29]回顾研究报道了在NPSCC中HPV阳性和HPV阴性患者的生存情况无显著差别。Xu等[7]在674例NPSCC中同样报道了HPV感染状态与患者预后无关，尽管HPV阳性NPSCC患者的生存时间较HPV阴性NPSCC患者的生存时间更长。本实验中P16阳性与阴性患者的3年总生存率分别为80%和65%，差异无统计学意义(P>0.05);HPV阳性和阴性患者的3年总生存率为77%和65%，差异无统计学意义(P>0.05)，且P16及HPV阳性患者的平均生存时间较HPV阴性患者长。这与国内外多数文献[1-3, 9]报道结果相符。HPV感染状态在LSCC患者生存情况并无明显差异，这可能是由于HPV感染在不同的HNSCC中转化过程不同造成的。

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(本文编辑 杨美琴)

Correlation between human papillomavirus infection and the pathogenesis and prognosis of laryngeal squamous cell carcinoma

LIUDan-ling，XUYa-nan，WANGJia-dong.
DepartmentofHeadandNeckSurgery，RenjiHospital,ShanghaiJiaotongUniversitySchoolofMedicine,Shanghai200001，China

WANG Jia-dong,Email：drjiadongw@aliyun.com

Objective To determine whether human papillomavirus (HPV) infection is related to the prevalence and prognosis of laryngeal squamous cell carcinoma(LSCC). Methods A retrospective cohort study was applied on a total of 252 LSCC patients enrolled from 2004 to 2013. Paraffin-embedded tissues were cut as 4 μm slices. P16 immunohistochemistry and fluorescence quantitation polymerase chain reaction (PCR) high risk HPV DNA tests were applied to detect the HPV infection status respectively in 252 specimens. Long-term survival rates were calculated using the Kaplan-Meier method. Results The p16 positive rate of all the patients was 7.1% (18/252). Six percent (15/252) of LSCC patients were HPV DNA positive. All the HPV DNA positive patients were p16 positive, 93.3%(14/15) of the HPV DNA positive patients were HPV type 16 and the rest was HPV type 18. The 3-year overall survival rates were 67.0% for all 252 patients, 77.0% for HPV DNA positive patients, 65.0% for HPV DNA negative patients (P=0.25). Conclusions HPV has low prevalence in Chinese LSCC people. HPV infection status is associated with LSCC but may not be an available prognostic factor for LSCC. (Chin J Ophthalmol and Otorhinolaryngol,2017,17:170-175)

Tumor, squamous cell, laryx; P16 protein; Papillomavirus, human; Survival rate

上海交通大学医学院附属仁济医院头颈外科 上海 200001

王家东(Email:drjiadongw@aliyun.com)

10.14166/j.issn.1671-2420.2017.03.006

2016-10-09)