诱导HO-1表达对慢性间歇性缺氧下INS-1细胞凋亡的影响

徐健 李小莉 李一禄 陈济明

诱导HO-1表达对慢性间歇性缺氧下INS-1细胞凋亡的影响

徐健 李小莉 李一禄 陈济明

目的 了解诱导HO-1表达对慢性间歇性缺氧下INS-1细胞凋亡的影响。方法 通过不同浓度CoPP作用于慢性间歇性缺氧下INS-1细胞，观察胰岛素水平、HO-1及Caspase-3水平，采用RT-PCR检测HO-1、Caspase-3mRNA表达。结果 随着CoPP浓度增高，胰岛素、HO-1表达逐渐增高，而Caspase-3逐渐降低，而CoPP浓度达到40umol/L时作用最强(P<0.05)。结论 慢性间歇性缺氧下诱导INS-1细胞HO-1表达，抑制凋亡相关蛋白Caspase-3，在一定程度上对细胞起保护作用。

慢性间歇性缺氧；INS-1；HO-1；凋亡；Caspase-3

阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征(OSAHS)以睡眠中反复发作的呼吸暂停或上气道梗阻为特征，常常与打鼾、睡眠中断、白天嗜睡和血氧饱和度降低相关[1]。研究证实，OSAHS引起的睡眠结构紊乱和间歇性低氧，能诱发氧化应激、炎症反应，激活交感神经系统，损伤血管内皮功能[2-7]。研究还发现，OSAHS是独立于肥胖的代谢综合征的危险因素[8]。OSAHS与糖尿病之间关系越来越受到重视，但具体机制尚不完全清楚。已有研究发现，胰岛细胞凋亡在糖尿病发生发展是重要机制之一。HO-1系统是机体重要的内源性保护系统，主要通过抗炎，抗氧化、抗凋亡等机制起作用[9-11]。我们探讨在间歇性缺氧条件下通过CoPP诱导INS-1胰岛细胞HO-1表达，对INS-1胰岛细胞凋亡的影响。

资料与方法

一、实验材料

胰岛β细胞株INS-1(上海拜力生物科技有限公司)；牛血清白蛋白(Sigma)；细胞培养试剂、胎牛血清、RPMI 1640培养基(均为Gibco)。CoPP(Sigma)。

二、方法

1 细胞培养：胰岛INS-1 细胞株购买后，用含10%新生牛血清，2mmol/LL-谷氨酰胺，1mmol/L 丙酮酸钠，50mmoL/L -巯基乙醇，1×105IU/L 青霉素和100mg/L 链霉素的RPMI1640培养基，在37℃，5% CO2及饱和湿度的恒温箱中培养，每2-3d 传代一次。

2 研究对象共分为六组： 将密度为1×105/mL的INS-1 细胞悬液接种至96 孔培养板，每组6个复孔，培养箱中培养24h 后，置于自制密闭仓中，暴露时以缺氧(1.5% O2)气流洗脱细胞培养中气体，继而维持缺氧状态时间(即IH 时段)，再以正常氧(21% O2)气体洗脱缺氧气体，而后再维持正常氧时间，周而复始形成循环。IH 暴露时间为12h，次数均为15次/h。细胞暴露的同时，分别加入不同浓度的CoPP(0、10、20、40、60、80)umol/L，12h后收集细胞及上清液进行相应检测。

3 细胞胰岛素分泌检测： 将细胞按5*104个/孔培养于24孔板, 暴露结束后，收集细胞上清液, 采用放射免疫分析法(试剂盒购于北京科美生物技术有限公司)测定胰岛素水平。

4 RT-PCR检测HO-1和Caspase-3 mRNA表达：采用TRIzol抽提细胞总RNA，按照标准抽提步骤进行RNA抽提；取样品1ug，逆转录为cDNA，采用PCR设计和评估软件Primer 3.0设计实时PCR引物。引物序列：HO-1上游引物：ACAGAAGAGGCTAAGACCG；下游引物：CAGGCATCTCCTTCCATT。Caspase-3上游引物：CATGGAAGCGAATCAATGGACT；下游引物：CTGTACCAGACCGAGATGTCA。取样本总cDNA2μl、上下游引物各1mL，按照试剂盒说明书配制相应反应参数的反应体系。PCR扩增条件：94℃预变性2min；95℃变性1min，60℃退火20s，72℃延伸30s，共45个循环。运用数据分析软件进行分析，采用2-△△Ct法计算，得到相对值。

三、统计分析

结 果

一、诱导HO-1表达对INS-1胰岛素分泌影响

研究发现随着CoPP浓度增加，胰岛素水平逐渐升高，当CoPP达到40umol/L时，INS-1细胞胰岛素水平最高(P<0.05)，以后随着浓度增加胰岛素水平逐渐下降。(见图1)。

图1 不同浓度CoPP对INS-1胰岛素分泌影响

二、诱导HO-1表达对INS-1细胞HO-1mRNA的影响

研究发现随着CoPP浓度增加，HO-1表达明显升高，呈剂量依耐性，CoPP达到40umol/L时，HO-1表达达到顶峰(P<0.05)。而后随着HO-1浓度增加，HO-1 mRNA表达未见继续增高。(见图2)。

图2 不同浓度CoPP对INS-1细胞HO-1mRNA表达的影响

三、诱导HO-1表达对INS-1细胞Caspase-3 mRNA的影响

研究发现随着CoPP浓度增加，Caspase-3 mRNA表达明显降低。当CoPP达到40umol/L时，能最大程度抑制Caspase-3 mRNA表达(P<0.05)。(见图3)。

图3 不同浓度CoPP对INS-1细胞Caspase-3 mRNA表达的影响

讨 论

近年来，随着研究深入发现OSAHS作为一种常见病，影响全身多个系统，目前认为是一种源头性疾病，导致严重后果。研究发现，OSAHS与糖尿病、冠心病、高血压、心律失常以及缺血性脑血管疾病存在内在联系[12-14]。多项研究表明，OSAHS与糖尿病存在明显相关性。同时，随着中国版OSAHS与糖尿病专家共识的发布，大家越来越关注此两种疾病。

慢性间歇性缺氧是OSAHS主要的致病机制之一，而胰岛素分泌不足和胰岛细胞凋亡增加也是糖尿病重要的发病机制。研究发现，慢性间歇性缺氧可引起胰岛素抵抗，加重大鼠胰岛细胞凋亡[15]，因此，凋亡可能是OSAHS与糖尿病内在关联纽带。同时，我们前期研究已证实，慢性间歇性缺氧能明显抑制INS-1胰岛素水平和诱导凋亡。

HO-1是血红素降解途径限速酶，具有抗炎、抗凋亡、抗增殖等多种生物学效应。现有的证据显示，诱导胰岛HO-1表达，能对抗细胞因子介导的有害影响。钴原卟啉(CoPP)，作为HO-1的底物，能增加HO-1的表达和活性。而有关HO-1与凋亡的研究中发现，HO-1可通过抑制Caspase-3表达起到抗凋亡作用[16]。Caspase-3是含半胱氨酸的天冬氨酸特异水解酶，在细胞凋亡早期及凋亡过程中起重要作用，是细胞凋亡的关键酶。在正常情况下以无活性的酶原形式存在于多种细胞胞质中，多种刺激因素可激活Caspase-3，活化的Caspase-3又进一步切割不同的底物，引起蛋白级联切割放大，最终使细胞凋亡[17]。

以往的研究表明，CoPP具有细胞保护作用，主要通过上调HO-1抑制凋亡相关蛋白capase-3表达[18]。Lundvig等人研究也发现，诱导HO-1表达能抑制高剂量姜黄素诱导的角质细胞凋亡[19]。本研究从体外细胞培养发现，CoPP能促进间歇性缺氧情况下INS-1细胞胰岛素分泌，抑制凋亡相关蛋白caspase-3表达，对细胞起到保护作用，且随浓度增加，在一定范围内作用越明显，当CoPP达到40umol/L时，其作用最明显。过度诱导HO-1表达则会因诱导剂的过量而产生毒性作用，使HO-1的表达减少，损害脏器功能[20]。因此，诱导HO-1表达通过抑制Caspase-1减轻INS-1凋亡。

综上所述，CoPP对间歇性缺氧影响下INS-1保护作用可能与诱导HO-1表达，抑制凋亡有关。

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Effect of induced HO-1 expression on INS-1 cells in chronic intermittent hypoxia

XUJian,LIXiao-li,LIYi-lu,CHENJi-ming
DepartmentofRespiratoryMedicine,ShenzhenNanshanDistrictPeople’sHospital,Shenzhen518052,China

Objective To understand the effect of HO-1 expression on the apoptosis of INS-1 cells induced by chronic intermittent hypoxia. Methods INS-1 cells were observed under different concentrations of CoPP in chronic intermittent hypoxia, and the levels of insulin were observed. It used RT-PCR to detect the expression of HO-1 and Caspase-3 mRNA. Results With the increase of CoPP concentration, the expression of insulin and HO-1 mRNA gradually increased, while Caspase-3 mRNA decreased. When the concentration of CoPP reached 40umol/L, the strongest effect was observed. Conclusion The induced expression of HO-1 in INS-1 cells can inhibit protein Caspase-3, and protected the cells at certain extent.

chronic intermittent hypoxia; INS-1; HO-1; apoptosis; Caspase-3

10.3969/j.issn.1009-6663.2017.07.023

广东省科技计划项目(No 2013B021800048)

518000 广东 深圳，深圳市南山区人民医院呼吸内科

2016-11-10]