雷帕霉素对哮喘缓解期小鼠模型气道炎症的作用

金华良 王利民 王娇莉 夏俊波 马胜林

●论 著

雷帕霉素对哮喘缓解期小鼠模型气道炎症的作用

金华良 王利民 王娇莉 夏俊波 马胜林

目的 探讨雷帕霉素对哮喘缓解期小鼠气道炎症的作用与机制。 方法 将 50 只 Balb/c 小鼠随机分为 5 组：正常对照组、哮喘缓解组、哮喘模型组、地塞米松组和雷帕霉素组，每组 10 只。采用卵蛋白致敏与激发制备哮喘模型，休息 3 周后，采用卵蛋白再次激发 1 周，在小鼠休息期间治疗组采用雷帕霉素或地塞米松干预。采用 Buxco 无创肺功能仪检测气道高反应性；Luminex 测定肺泡灌洗液 IL-4、IL-5、IL-13、IL-17 及 INF-Y 水平；肺组织 HE 染色评价观察小鼠肺组织气道炎症；Western blot检测肺组织 p-S6、S6、AKT、p-AKT（S473）蛋白含量；流式分析测定肺泡灌洗液 CD4+CD25+Foxp3+Treg 细胞百分率。 结果 与正常组及哮喘缓解组比较：哮喘模型组气道反应性升高（P＜0.01），灌洗液 IL-4、IL-5、IL-13 及 IL-17 水平增加（均 P＜0.01），肺组织气道炎症评分增高（P＜0.01），肺组织 mTORC1 信号通路下游蛋白 p-S6 蛋白增加（P＜0.01），灌洗液 Treg 细胞比例上升（P＜0.01）；与模型组比较：雷帕霉素在乙酰甲胆碱浓度为 6.25mg/ml时,可降低 Penh 值（P＜0.01），同时降低肺泡灌洗液 IL-4 水平（P＜0.01），并抑制肺组织炎症细胞浸润（P＜0.01），而肺组织 mTORC1 信号通路下游蛋白 p-S6 蛋白下降（P＜0.01），但雷帕霉素可降低肺泡灌洗液 Treg 细胞比例（P＜0.01）。 结论 在哮喘缓解期应用雷帕霉素，其可通过 mTORC1 信号通路显著抑制哮喘急性发作时气道炎症；在哮喘缓解期应用雷帕霉素，对控制哮喘再次发作具有积极作用。

雷帕霉素 哮喘 mTOR 信号通路

【 Abstract 】 Objective To investigate the effects of rapamycin on airway inflammation in mice with asthma during remission. Methods Fifty Balb/c mice were randomly divided into 5 groups:normal control,asthma,asthma in remission, dexamethasone and rapamycin groups with 10 mice in each group.The asthma model was induced by ovalbumin(OVA) sensitization and challenge;after 3-week interval the mice were challenged by OVA again.Dexamethasone,rapamycin or saline was given to 3 groups,respectively during 3-week interval.Airway reactivity was measured by Buxco's non-invasive system. Cytokines IL-4,IL-5,IL-13,IL-17 and INF-Y in bronchoalveolar lavage fluid(BALF)were assessed by Luminex method.Lung tissues were examined for inflammatory cell infiltration.The expression of p-S6,S6,AKT and p-AKT(S473)in lung tissue was examined by Western blot.CD4+CD25+Foxp3+Treg cells in BALF was assessed by flow cytometry. Results Compared with the normal and remission groups,OVA re-expose significantly increased airway hyperresponsiveness(P＜0.01),elevated IL-4,IL-5, IL-13,IL-17 levels(P＜0.01),and reduced INF-Y in the BALF(P＜0.01);it also markedly increased inflammatory cells in lung tissue,increased Ttreg cells in BALF and decreased expression of p-S6(P ＜0.01).Rapamycin significantly reduced airway hyperresponsiveness to aerosolized methacholine at 6.25mg/ml(P＜0.01),inhibited IL-4 level in BALF,and markedly decreased inflammatory infiltration in lung tissues(P＜0.01).Notably,rapamycin significantly inhibited the expression of p-S6;and also Treg cells in BALF were significantly reduced after rapamycin treatment. Conclusion Antiasthmatic effects of rapamycin during remission time are at least partially through mTORC1 signaling pathway,and rapamycin may be used for asthma patients in remission to control asthma attack.

【 Key words 】 Rapamycin Asthma mTOR signaling pathway

支气管哮喘是一种以慢性气道炎症、气道高反应为特征，伴随气道上皮杯状细胞增生，黏液高分泌，IgE 显著增加，以 Th2反应为优势的慢性变态反应性疾病[1]。尽管糖皮质激素与支气管扩张剂是哮喘主要治疗药物，但这些药物并非对所有哮喘患者有效[2]，哮喘患病率与发病率仍呈升高趋势[3]。雷帕霉素可作用于哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）信号通路，显著改善哮喘气道炎症与气道高反应性[4]。然而雷帕霉素对哮喘治疗作用尚存在争议，不同时期应用其效果可能存在较大差异[5]。而在哮喘缓解期应用雷帕霉素，是否可改善哮喘气道炎症目前尚不清楚。本研究通过制备哮喘缓解期小鼠模型，探讨在哮喘缓解期应用雷帕霉素对哮喘急性发作时气道炎症的改善作用及机制，现报道如下。

1 材料和方法

1.1 实验动物和试剂 健康 6 周龄 Balb/c 小鼠 50 只（体重 16～20g），由上海西普尔必凯实验动物有限公司提供。采用随机数字表法将小鼠分为 5 组：正常对照组、哮喘缓解组、哮喘模型组、地塞米松组和雷帕霉素组，每组 10 只。卵蛋白（V 级）和乙酰甲胆碱购于美国 Sigma公司；雷帕霉素购自美国 Gene operation 公司；免疫佐剂购于美国 Thermo Fisher 公司；小鼠调节性 T 细胞检测试剂盒、IL-4、IL-5、IL-13、IL-17 及 INF-γ 均购于美国Ebioscience（San Diego)公 司；小 鼠 无 创 肺 功 能 仪 、流 式细胞仪分别为美国 buxco 公司、BD 公司产品；小鼠哮喘造模雾化仪器（Boy Sx 085G3005）为德国百瑞公司产品。

1.2 方法

1.2.1 模型制备 将 Balb/c 雌性小鼠于实验第 0 天腹膜腔内注射致敏液 0.1ml+皮下 0.1ml（含卵蛋白 40μg和免疫 佐 剂 0.05ml，0.9%氯化钠溶液 约 0.15ml）， 第 7天、第 14 天重复致敏，第 21 天起用 1%的卵蛋白氯化钠溶液雾化吸入激发，1 次/d，每次 30min，连续 1 周；第 28 天起停止激发 3 周，第 49 天起再次卵蛋白连续激发 1 周。同时第 49 天处理哮喘缓解组,第 56 天处理其余小鼠。并予实验第 28 天至第 48 天（共 3 周）各干预组连续灌胃相应药物（0.9%氯化钠溶液、地塞米松 1mg/kg或雷帕霉素 4mg/kg）。正常对照组用等量 0.9%氯化钠溶液进行雾化吸入。

1.2.2 气道高反应检测 将自然状态下的 Balb/c 小鼠置入体描箱中，先测定基础增强呼气间歇（enhanced pause，Penh）值；随后用乙酰甲胆碱激发，浓度由低到高依次为 0、6.25、12.5、25 和 50g/L，记录此时的 Penh 值，每次雾化吸入 1min，记录 3min。Penh 计算公式：呼气峰压力（PEP）/吸 气 峰 压 力（PIP）× 呼 气 间 歇（Pause），其 中Pause=（Te-Tr）/Tr。Te：呼气相时间；Tr：呼气相松弛时间。

1.2.3 肺泡灌洗液细胞因子检测 待肺功能检测后，将小鼠处死。使用注射器吸取 PBS 液 1ml从导管缓慢注入灌洗双肺，可见小鼠肺部逐渐膨胀，颜色由红色变成粉白色，待液体完全进入肺内，轻压肺部，以保证充分灌洗，5s后回抽液体，反复 2 次，回收率为 60%～80%。将液体离心，3 000r/min，取上清液,采用 Luminex 测定肺泡灌洗液 IL-4、IL-5、IL-13、IL-17 及 INF-γ，细胞沉淀留取用于流式实验。

1.2.4 肺组织 HE 染色 取右肺上叶，10%的中性甲醛溶液固定，脱水、石蜡包埋、连续切片，厚 4μm，行 HE 染色，光镜下观察小鼠支气管黏膜下和周围肺组织炎性细胞浸润。参照文献[6]对炎症浸润程度进行评分：0 分，没有炎症细胞；1 分，少量炎症细胞；2 分，炎症细胞形成环状，层厚 1 个细胞；3 分，炎症细胞形成环状，层厚 2～4个细胞；4 分，炎症细胞形成环状，层厚 4～5 个细胞；5分，炎症细胞形成环状，层厚＞5 个细胞。

1.2.5 Western blot 检测 取肺组织提取总蛋白，BCA法测定蛋白浓度，每组取 50μg 的总蛋白，按 1∶4 加入SDS 上样缓冲液，沸水浴中加热 5min，然后进行 SDSPAGE 电泳，转膜，5%牛奶封闭 1h，分别加入 p-S6，S6，AKT，p-AKT（S473）一抗和内参 Actin 孵育过夜，TBST洗涤 3 次，加入辣根过氧化物酶标记的二抗，室温与膜孵育 1h，TBST 洗涤 3 次，ECL 法曝光后洗片，扫描后用Quantity One 灰度分析软件进行光密度计算，以目的蛋白条带灰度值与内参 Actin 灰度值的比值作为相应母的蛋白的表达量指标。

1.2.6 流式细胞术 留取肺泡灌洗液同上，将灌洗液离心沉淀后 PBS 重悬，流式缓冲液洗涤后，加入相应的荧光标记单抗（anti-CD4-FITC，anti-CD25-APC）,轻轻混匀，冰上避光孵育 30min。用流式细胞染色缓冲液洗涤后，加入 1ml细胞固定和破膜液，冰上避光孵育 30 min。破膜缓冲液洗涤 2 次，加入 anti-Foxp3-PE, 冰上避光孵育60min，用破膜缓冲液洗涤后上流式仪检测。采用 Flowjo软件计算 CD4+CD25+Foxp3+Treg 细胞占 CD4+T 细胞比例。

1.3 统计学处理 采用 SPSS13.0 统计软件，计量资料以表示，多组比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用 Dunnet-t法。

2 结果

2.1 不同浓度乙酰甲胆碱时各组小鼠 Penh 值比较见图1。

图1 不同浓度乙酰甲胆碱时各组小鼠 Penh 值比较（与哮喘模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01）

由图 1 可见，哮喘模型组小鼠的 Penh 值明显升高，与正常对照组及哮喘缓解组相比差异均有统计学意义（P＜0.01）。在乙酰甲胆碱浓度为 6.25、12.5mg/ml时，地塞米松组小鼠 Penh 值明显下降，与哮喘模型组相比差异有统计学意义（P＜0.05）。在乙酰甲胆碱浓度为 6.25mg/ ml时，雷帕霉素组小鼠 Penh 值明显下降，与哮喘模型组相比差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.2 各组小鼠肺泡灌洗液细胞因子比较 见表 1。

由表 1 可见，哮喘模型组小鼠肺泡灌洗液 IL-4、IL-5、IL-13 及 IL-17 水平显著上升，而 INF-γ 水平显著下降，与正常对照组、哮喘缓解组相比差异均有统计学意义（P＜0.05 或 0.01）；地塞米松组 IL-4、IL-5、IL-13及 IL-17 水 平 较 哮 喘 模 型 组 显 著 下 降 （P ＜0.05 或0.01）；雷帕霉素组较哮喘模型组 IL-4 水平显著下降（P＜0.01），而 IL-5、IL-13、IL-17 及 INF-γ 水平差异均无统计学意义（均 P ＞0.05）。

表1 各组小鼠肺泡灌洗液细胞因子比较（ng/L）

2.3 各组小鼠肺组织气道炎症评分及肺组织病理变化肺组织气道炎症评分正常对照组（1.08±0.27）分，哮喘缓解组（2.45±0.90）分，哮喘模型组（4.42±0.70）分，地塞米松组（2.22±0.70）分，雷帕霉素组（2.71±0.18）分。哮喘模型组小鼠肺气道炎症评分显著升高，与其余 4组比较差异均有统计学意义（均 P＜0.01）。各组小鼠肺组织病理变化见图2。

2.4 各组小鼠肺组织 mTOR 下游信号通路蛋白变化见图3。

由图 3 可见，哮喘模型组 mTORC1信号通路下游蛋白 p-S6 蛋白显著增加，与正常对照组相比差异有统计学意义（P＜0.01）；而哮喘缓解组、雷帕霉素组 p-S6蛋白较哮喘模型组下降（P＜0.05）；哮喘模型组 mTORC2信号通路下游蛋白 p-AKT（S473）蛋白与正常对照组、雷帕霉素组差异均无统计学意义（均 P ＞0.05）。

图2 各组小鼠肺组织病理图（a：正常对照组，b：哮喘缓解组，c：哮喘模型组，d：地塞米松组，e：雷帕霉素组；HE 染色，×100）

2.5 各组小鼠肺泡灌洗液 CD4+CD25+Foxp3+Treg 细胞变化 各组小鼠肺泡灌洗液 Treg 细胞比例：正常对照组 3.60±1.20，哮喘缓解组 1.15±0.45，哮喘模型组 5.62± 0.39，地塞米松组 2.91±0.56，雷帕霉素组 2.41±0.55。哮喘模型组肺泡灌洗液 Treg 细胞比例显著增加，与其余 4组比较差异均有统计学意义（均 P＜0.01）。各组肺泡灌洗液 Treg 细胞比例见图 4。

3 讨论

本研究通过制备哮喘缓解期小鼠模型，探讨雷帕霉素在哮喘缓解期的应用价值，研究发现哮喘缓解期小鼠经卵蛋白再次激发后，其气道高反应性与气道炎症较正常组显著升高，肺泡灌洗液细胞因子 IL-4、IL-5、IL-13及 IL-17 较正常组显著升高，而 INF-γ 显著下降。而在缓解期应用雷帕霉素，哮喘小鼠的气道炎症及气道高反应性均有所改善。既往研究发现在哮喘造模早期应用雷帕霉素，可以显著改善气道炎症与气道高反应性[4]。但在哮喘模型制备成功后再给予雷帕霉素干预，其治疗效果存在争议：有研究发现在哮喘模型制备后休息 6 周（相当于缓解期），再次用抗原激发哮喘，激发期间同时予雷帕霉素治疗，发现雷帕霉素仍能在一定程度上改善哮喘气道炎症，包括降低总的效应 T 细胞，减少杯状细胞，降低 IgE 水平[7]；但也有研究发现在慢性哮喘模型后期，给予雷帕霉素干预，则发现其作用有限，反而加重气道高反应与气道炎症[5]。但关于在哮喘缓解期应用雷帕霉素，对控制哮喘急性发作的应用价值，目前鲜有报道。本研究发现在哮喘模型制备后，在缓解期给予雷帕霉素治疗，遇抗原再次激发时，可显著缓解哮喘肺组织炎症及气道高反应性。IL-4 可以招募嗜酸性粒细胞及其他效应性细胞，促进 B 细胞分泌 IgE，增加杯状细胞黏液分泌，参与气道炎症的发生和发展[8]。本研究发现雷帕霉素可降低肺泡灌洗液 IL-4 水平，说明雷帕霉素对气道炎症的改善作用可能与此相关。

图3 mTOR 下游信号通路蛋白 p-S6、p-Akt的变化（与哮喘模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01）

图4 各组肺泡灌洗液 Treg 流式细胞图（a：正常对照组，b：哮喘缓解组，c：哮喘模型组，d：地塞米松组，e：雷帕霉素组）

由于 mTOR 信号通路与哮喘气道炎症密切相关，故本研究进一步探讨了雷帕霉素对哮喘 mTOR 相关信号通路的作用。mTOR 为进化上高度保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，分子量大小为 289kDa，通过形成两种复合物在细胞内传递信号：mTORCl（mTOR complex 1）和mTORC2（mTOR complex 2）[9]。Raptor 与 Rictor 分别为mTORCl和 mTORC2 的关键基因。激活 mTORCl信号通路促进下游核糖体蛋白 S6 激酶与 4EBP1 磷酸化水平，而 mTORC2 信号通路则促进 Akt（S473）磷酸化水平[10]。雷帕霉素是 mTOR 信号通路的抑制剂，小剂量雷帕霉素（500pM）只能抑制 mTORC1 信号通路，而大剂量（500nM） 可同时抑制 mTORC1 与 mTORC2 信号通路。本研究发现雷帕霉素能显著抑制 mTORC1信号通路下游 p-S6 蛋白，但对 mTORC2 下游蛋白 p-AKT（S473）无显著影响，说明本研究中雷帕霉素浓度只能抑制mTORC1 信号通路。mTOR 信号通路对 T 细胞的增殖具有重要的调节作用，研究发现将 Raptor基因敲除（即阻断 mTORC1 信号通路），T 细胞增殖受到显著影响[11]。与mTORC2 作用的区别是，阻断 mTORC1 信号通路可抑制 Th2细胞分化与功能[12]。如上所述，本研究发现雷帕霉素可降低 Th2细胞因子 IL-4 水平。由于 Th2细胞在哮喘中发挥关键作用，故而本研究中雷帕霉素对哮喘模型气道炎症的改善作用，应与其抑制 mTORC1 信号通路，从而抑制 Th2反应相关。

mTOR 信号通路可调控细胞的生长、增殖及代谢，可调控 Treg 细胞分化与增殖。雷帕霉素可通过抑制mTOR 信号通路，而缓解哮喘气道炎症，因此本研究进一步探讨雷帕霉素对哮喘 Treg 细胞作用变化。而 Treg对气道炎症具有重要的调节作用，研究认为 Treg 细胞可通过多种机制抑制效应性T细胞活化，从而控制哮喘气道炎症，其可能途径包括：通过表达细胞溶解性 T 淋巴细胞相关抗原-4（CTLA-4），以细胞接触方式抑制效应性 T 细胞活化；通过分泌抑制性细胞因子 IL-10 及TGF-β，从而抑制效应性 T 细胞；分泌穿孔素，使效应性T 细胞裂解；与效应性 T 细胞竞争细胞生长因子 IL-2，抑制效应性T细胞分化。既往体外实验发现雷帕霉素在IL-2 存在的前提下可以显著促进 Treg 细胞扩增[13]。然而本研究发现雷帕霉素与地塞米松均导致哮喘小鼠Treg 细胞比例显著下降。由于在本研究中，雷帕霉素同时降低了效应性 T 细胞，其是产生 IL-2 的重要来源。故而与地塞米松作用类似，雷帕霉素降低 Treg 细胞可能与抑制产生 IL-2 来源的细胞有关。既往研究也发现在哮喘模型中，雷帕霉素与地塞米松均可使调节性 T细胞比例下降[7]。另有研究也发现重度哮喘患者肺泡灌洗液Treg 细胞比例较轻度患者显著增加，并与气道炎症相关。这说明哮喘 Treg 细胞比例与炎症细胞（特别是产生IL-2 细胞）相关[14]。此外，体外研究发现只有同时阻断mTORCl和 mTORC2 信号通路, 才能促进 Treg 细胞分化与增殖[15]，而本研究中所采用的雷帕霉素剂量，仅阻断了 mTORCl信号通路，而未能阻断 mTORC2 信号通路，因此未能促进 Treg 细胞增殖。

本实验通过在哮喘模型缓解期应用雷帕霉素，证实其可通过抑制 mTORC1信号通路，从而缓解哮喘急性发作时气道炎症与气道高反应性。而与体外实验相反的是，在哮喘动物模型缓解期应用雷帕霉素后，遇抗原再次激发时，哮喘 Treg 细胞水平下降，其可能与雷帕霉素所采用的剂量相关。

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Effects of rapamycin on airway inflammation in mice with asthma during remission

JIN Hualiang,WANG Limin,WANG Jiaoli,et al.
Department of Respiratory Medicine,Hangzhou First People's Hospital,Hangzhou Hospital of Nanjing Medical University,Hangzhou 310006,China

2017-01-02）

（本文编辑：马雯娜）

10.12056/j.issn.1006-2785.2017.39.11.2017-19

国家自然科学基金（81403247/H2902）；浙江省医药卫生科技项目（2014KYA170）

310003 杭州市第一人民医院 / 南京医科大学附属杭州医院呼吸科

马胜林，E-mail：mashenglin@medmail.com.cn