鹿骨双酶法酶解工艺的研究

于浩，张海悦，李震，杨雪（长春工业大学化学与生命科学学院，吉林长春130012）



鹿骨双酶法酶解工艺的研究

于浩，张海悦*，李震，杨雪
（长春工业大学化学与生命科学学院，吉林长春130012）

摘要：以新鲜鹿骨为原料，探讨鹿骨酶解的最佳工艺条件；以水解度为指标，确定以碱性蛋白酶和胰蛋白酶为试验用酶，通过正交试验确定鹿骨双酶法酶解的最佳工艺条件。结果表明：碱性蛋白酶在pH 9.0、温度50℃的条件下水解时间为3 h，再在pH 8.0、温度37℃条件下，加入胰蛋白酶水解2 h，此时的水解度为12.72%，分别是碱性蛋白酶和胰蛋白酶最大水解度的1.84倍和1.39倍。

关键词：鹿骨；双酶；水解度；工艺

动物药是中药三大来源之一，资源广，疗效强，但因动物药在常用中药中仅占1/10［1-2］，故其研究深度远远落后于植物药。梅花鹿是动物药之首，临床使用量大，疗效确切。鹿骨是鹿的骨骼，具有补肾壮阳、益气补血、祛风除湿功能，对久病体弱、精髓不足、贫血、风湿、四肢疼痛等症有较好的临床疗效［3-5］。可见鹿骨不仅营养价值很高，含有大量的人体所需的营养保健物质，而且可治疗多种疾病如骨质增生，-OH自由基清除［6］。还含有大量胶原蛋白，约占57%，还有磷脂质、糖蛋白、维生素，多种矿物质元素如钙、镁、铁、锌、钾、铜等，鹿骨的软骨中还富含大量的酸性粘多糖及其衍生物，具有重要的生理功能和多种药理活性［3，7］。长春市双阳区作为中国鹿乡，有成规模的养殖场，先后开发出鹿血酒，鹿胎膏，人参鹿血粉等一系列产品，但鹿骨作为附产品，其附加值还很低，鹿骨的开发利用，也是增加养鹿企业经济效益的有效途径之一。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

胃蛋白酶（3 000 N.F.U/mg）：合肥新安原生物科技有限公司；胰蛋白酶（250 N.F.U/mg）：合肥新安原生物科技有限公司；木瓜蛋白酶（6 000 U/mg）：北京博奥拓达科技有限公司；中性蛋白酶（130 000 U/mg）：上海惠世生化试剂有限公司；碱性蛋白酶（100 000 U/mg）：上海惠世生化试剂有限公司。

试验用新鲜鹿骨：由长春世鹿鹿业有限公司提供，其余试剂均为分析纯。

1.2仪器与设备

DF-101S集热式搅拌器：金坛市科析仪器有限公司；DHG-9070A型电热恒温鼓风干燥箱：上海精宏实验设备有限公司；FW135中草药粉碎机：天津市泰斯特仪器有限公司；PHS-3C型精密pH计：上海虹益仪器仪表有限公司。

1.3试验方法

1.3.1工艺流程［8-9］

新鲜鹿骨→预处理→高压蒸煮→去除骨髓→一次干燥→粗粉碎→酶处理→二次干燥→冷却→微粉碎→灭菌包装

1.3.2操作要点

1）预处理：清水洗净鹿骨，剔除残留肉、筋、骨膜等非骨成分；

2）高压蒸煮：0.1 MPa高压蒸煮3 h，65℃恒温干燥6 h；

3）粗粉碎：将干燥后的鹿骨进行粗粉碎，粒径1 cm～2 cm；

4）酶处理：用碱性蛋白酶在pH 9.0、50℃条件下水解3 h，高温灭酶，调至pH 8.0、37℃条件下，加入胰蛋白酶水解2 h；

5）二次干燥：经酶处理后的骨粉在70℃、5 h条件下干燥；

6）微粉碎：经微粉碎机粉碎后，粒径过300目筛。

1.3.3单酶的选择

以粗粉碎后的鹿骨为底物，分别用胰蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶和胃蛋白酶，在各自最适温度、最适pH下进行水解试验，比较各酶对鹿骨蛋白的水解度。

1.3.4单酶水解单因素试验

单因素试验是以鹿骨蛋白的水解度为评价指标，分别研究酶底比、pH、温度、时间对水解度的影响。图1至图6为单因素试验结果图。

1.3.5单酶的正交优化试验

在1.3.4研究结果的基础上，为确定两种酶分别单独使用时的最佳水解条件，选择酶底比、pH、温度、时间对这两种单酶分别做四因素三水平正交试验，表2、表3分别为碱性蛋白酶和胰蛋白酶的正交因素表，表4、表5分别为两者的正交结果表。

1.3.6双酶组合法酶解试验

组合1：同时加入碱性蛋白酶和胰蛋白酶，在37℃、pH8.0条件下酶解5 h，测定鹿骨蛋白的水解度；

组合2：同时加入碱性蛋白酶和胰蛋白酶，在50℃、pH9.0条件下酶解5 h，测定鹿骨蛋白的水解度；

组合3：先将胰蛋白酶37℃、pH8.0酶解2 h后，再加入碱性蛋白酶50℃、pH9.0酶解3 h，测定鹿骨蛋白的水解度；

组合4：先将碱性蛋白酶50℃、pH9.0酶解3 h后，再加入胰蛋白酶37℃、pH8.0酶解2 h，测定鹿骨蛋白的水解度。双酶组合法酶解的结果如表6所示。

1.3.7总氮含量测定

凯氏定氮法，参照GB 5009.5-2010《食品安全国家标准食品中蛋白质的测定》。

1.3.8游离氨基态氮的测定

甲醛电位滴定法，参照GB 5009.39-2003《酱油卫生标准的分析方法》。

1.3.9水解度的测定

水解度DH表示原料蛋白质中肽键被裂解的百分数，即蛋白质被酶催化水解的程度［10］，水解度按公式（1）计算：

式中：DH为水解度，%；N0为样品总氮含量，%；N1为酶解前游离氨基态氮含量，%；N2为酶解后游离氨基态氮含量，%。

2　结果与分析

2.1单酶的选择

单酶水解效果对比试验如表1所示。

表1　单酶水解效果对比试验Table 1 Hydrolysis effect contrast test of single enzyme

根据（GB 5009.5-2010）凯式定氮法，测得鹿骨中蛋白含量为26.2%。

由表1可知，在5种常用蛋白酶各自最适条件下，鹿骨水解效果最好的是胰蛋白酶和碱性蛋白酶，两者的水解度分别为8.74%和6.98%。但这一结果与袁永俊等的结果有所不同。袁永俊等发现在鱼肉蛋白酶解时，胰蛋白酶和胃蛋白酶的水解效果较好［10］。这可能是由于鱼肉蛋白在人体中的消化场所主要在胃部，其最适的环境为酸性；而鹿骨蛋白的水解却需要在碱性条件下所导致的。

2.2单因素结果分析

2.2.1酶底比对水解度的影响

酶底比对水解度的影响如图1所示。

图1　酶底比对水解度的影响Fig.1 Effect of the ratio of enzyme to substrate on hydrolysis degree

由图1可知，随着酶底比的增加，酶与底物的接触几率更大，酶解时水解度快速上升，碱性蛋白和胰蛋白酶在酶底比为1∶80时上升速率最高；但随着水解反应进行，鹿骨蛋白的水解度趋于平稳，酶底比达到1∶100之后趋于平稳，说明已经达到酶的最大水解能力。综合考虑，碱性蛋白酶和胰蛋白酶的最佳酶底比均为1∶100。

2.2.2pH对水解度的影响

pH对碱性蛋白酶水解度的影响如图2所示；pH对胰蛋白酶水解度的影响如图3所示。

图2　pH对碱性蛋白酶水解度的影响Fig.2 Effect of pH value on Alkaline hydrolysis

图3　pH对胰蛋白酶水解度的影响Fig.3 Effect of pH value on Trypsin hydrolysis

由图2、图3可知，酶在最适pH范围内对水解效果的影响较小，偏离最适pH范围则影响较大。pH影响酶的稳定性，对水解反应影响较大，碱性蛋白酶在pH 9.0左右时，鹿骨蛋白的水解度最大为6.33%，胰蛋白酶在pH 8.0左右时，鹿骨蛋白的水解度最大为7.45%。且由图形可见，碱性蛋白酶的pH范围要相对较宽，说明在最适pH附近的酸碱环境，碱性蛋白酶依然可以发挥酶解作用。综上所述，选择pH为9.0和8.0作为碱性蛋白酶和胰蛋白酶的最适pH。

2.2.3时间对水解度的影响

时间对水解度的影响如图4所示。

由图4可知，随着时间的增加，水解度先呈大幅上升趋势；但当水解度接近最大值时，随着时间的增加，水解能力增加的速度逐渐趋向平缓，这可能是由于随着水解的进行，酶的酶解能力已经达到饱和。综合考虑效率和时间成本，碱性蛋白酶和胰蛋白酶的水解时间分别为3 h和2 h。

2.2.4温度对水解度的影响

温度对碱性蛋白酶水解度的影响如图5所示；温度对胰蛋白酶水解度的影响如图6所示。

图4　时间对水解度的影响Fig.4 Effect of time on hydrolysis degree

图5　温度对碱性蛋白酶水解度的影响Fig.5 Effect of temperature on alkaline hydrolysis

图6　温度对胰蛋白酶水解度的影响Fig.6 Effect of temperature on trypsin hydrolysis

由图5、图6可知，温度对水解度的影响较为明显，在一定范围内随反应温度升高，水解度增加，但超过一定温度之后，水解度呈下降趋势，这是由于随着温度变高，酶中的蛋白质开始变性，导致酶的活性降低，酶解效率也随之降低，故碱性蛋白酶的最适温度选择为45℃，胰蛋白酶的最适温度选择为37℃。

2.3两种酶水解条件的优化

根据单因素试验的结果，分别以pH、温度、时间、酶底比这4个因素做正交试验。表2、表3分别为碱性蛋白酶和胰蛋白酶的因素水平表，两者的正交试验结果分别如表4、表5所示。

表2　碱性蛋白酶正交试验因素水平表Table 2 Factors and levers of orthogonal experimental design of alkaline

表3　胰蛋白酶正交试验因素水平表Table 3 Factors and levers of orthogonal experimental design of trypsin

表4　碱性蛋白酶正交试验结果表Table 4 The results and analysis of orthogonal experiment of alkaline

表5　胰蛋白酶正交试验结果表Table 5 The results and analysis of orthogonal experiment of trypsin

由表4可知，极差R是B＞C＞A＞D，也就是说，影响碱性蛋白酶水解度的主次因素是pH＞温度＞酶底比＞水解时间。从K值中可知，碱性蛋白酶水解的最佳组合为A3B2C2D2，即酶底比为1∶120（质量比），pH为9.0，温度为50℃，水解时间为3 h，验证试验发现此条件下鹿骨的水解度为6.92%。而正交试验中的最佳组合为A1B2C2D2，该条件下鹿骨的水解度为6.53%。因此，正交优化出来的组合水解能力要大于实际的最优值，故选取正交优化出的数据组合。

由表5可知，极差R是B＞C＞D＞A，也就是说，影响胰蛋白酶水解度的主次因素是pH＞温度＞水解时间＞酶底比。从K值中可知，胰蛋白酶水解的最佳组合为A3B2C2D2，即酶底比1∶120（质量比），pH为8.0，温度为37℃，水解时间为2 h，验证试验发现此条件下鹿骨的水解度为9.12%。而正交试验中的最佳组合为A2B2C3D1，该条件下鹿骨的水解度为8.63%。因此，正交优化出来的组合水解能力要大于实际的最优值，故也选取正交优化出的数据组合。

由上述验证试验可知，胰蛋白酶和碱性蛋白酶在正交优化出的最佳条件下，胰蛋白酶的最大水解能力仍然要强于碱性蛋白酶的水解能力，为后者的1.32倍。

2.4双酶组合对水解度的影响

双酶组合酶解试验如表6所示。

表6　双酶组合酶解试验Table 6 Double enzyme hydrolysis test combination

1）如表6中所示，双酶法的水解能力总体上是优于单酶法的。且将碱性蛋白酶在50℃、pH9.0酶解3 h后，再加入胰蛋白酶在37℃、pH8.0酶解2 h，该方法下鹿骨的水解度最大，可达到12.72%，分别是单独使用碱性蛋白酶和胰蛋白酶最大水解度的1.84倍和1.39倍。

2）组合1的水解能力要优于组合2。原因在于组合1中37℃、pH8.0的条件，未达到碱性蛋白酶的最佳酶解条件，此时碱性蛋白酶的活性未得到完全激发，但仍具备一定的水解能力；而组合2中50℃、pH 9.0的条件，已超过胰蛋白酶的最佳酶解条件，此时胰蛋白酶的活性已经开始部分失活，造成其水解的能力要低于前者。组合4的水解度尽管是最大的，但相对于组合3来说，优势并非很明显，也很有可能是上述原因造成的。

3　结论

1）在相同条件下，5种常用蛋白酶的水解效果，胰蛋白酶和碱性蛋白酶对鹿骨的水解效果要优于其他3种酶。

2）胰蛋白酶和碱性蛋白酶单独使用时，正交试验优化出来的最佳条件分别是：碱性蛋白酶在酶底比为1∶120（质量比），pH为9.0，温度为50℃，水解时间为3 h后，鹿骨的水解度为6.92%；胰蛋白酶在酶底比1∶120（质量比），pH为8.0，温度为37℃，水解时间为2 h，鹿骨的水解度为9.12%，为前者的1.32倍。

3）双酶法的水解能力总体上是优于单酶法的。且将碱性蛋白酶在50℃、pH9.0酶解3 h后，再加入胰蛋白酶在37℃、pH8.0酶解2 h，该方法下鹿骨的水解度最大，可达到12.72%，分别是单独使用碱性蛋白酶和胰蛋白酶最大水解度的1.84倍和1.39倍。

参考文献：

［1］邓明鲁.中国动物药资源［M］.北京：中国中医药出版社，2007：323-325

［2］江新业.多肽骨粉制作工艺及市场分析［J］.中外食品工业，2006 （5）：44-46

［3］张敏，陈晓燕.鹿骨粉制作工艺及营养成分分析［J］.食品科技，2004（1）：95-97

［4］刘彦明，陈志勇，韩金土，等.微波消解/电感耦合等离子体质谱测定鹿骨粉中微量元素［J］.光谱学与光谱分析，2006，26（5）：947-949

［5］罗惠波，李再新，赵金松，等.鹿龟酒鹿骨胶酶水解工艺条件的研究［J］.酿酒科技，2005（10）：79-80

［6］赵玉红，韩琳琳，高天，等.鹿骨胶原蛋白的酶解及其水解物羟自由基清除活性的研究［J］.东北农业大学学报，2007，38（6）：780-783

［7］庞广昌，陈庆森，杨晓宁.动物骨头的利用研究［J］.食品科学，1998，19（4）：34-36

［8］G G伯奇，郑寿亭，郑士民，等.酶与食品加工［M］.北京：轻工业出版社，1991：160-209

［9］吴敏，尹彦洋，罗爱平，等.双酶分步水解牛骨蛋白工艺的优化［J］.食品科学，2009，30（20）：223-226

［10］袁永俊，高健.水解鱼肉蛋白的酶法制备［J］.食品与机械，2002（3）：13-16

The Research of the Enzymolysis of Deer Bone Meal Using Double-enzyme Hydrolysis

YU Hao，ZHANG Hai-yue*，LI Zhen，YANG Xue
（Chemistry and Life Science College，Changchun University of Technology，Changchun 130012，Jilin，China）

Abstract：Fresh deer bones were used as raw materials to find the optimal conditions to enzymolysis deer bone. Taking degree of hydrolysis as index，alkaline protease and trypsin were chosen as the two tool enzymes. Based on orthogonal experiment，the optimum conditions of double-enzyme hydrolysis was conducted. The results showed that the optimum conditions of enzymatic hydrolysis was alkaline protease at pH 9.0，50℃for 3 hours and then trypsin at 37℃，pH 8.0 for another 2 hours，the hydrolysis degree could be reached 12.72%.Compared with those of hydrolyzing with alkaline protease and trypsin alone，hydrolysis degree were 1.84 times and 1.39 times，respectively.

Key words：deer bone；double-enzyme；hydrolysis degree；technology

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.09.019

作者简介：于浩（1990—），男（汉），在读硕士研究生，研究方向：天然产物的提取。

*通信作者

收稿日期：2015-03-17