分子伴侣促进截短型人乳头瘤病毒58亚型L1蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达

冉云伟，张改平，刘运超，陈玉梅，王聚财，孟凤丽，王爱萍

1.郑州大学 生命科学学院，河南 郑州 450001；

2.河南省农业科学院 动物免疫学重点实验室，河南 郑州 450002

分子伴侣促进截短型人乳头瘤病毒58亚型L1蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达

冉云伟1，张改平2，刘运超2，陈玉梅1，王聚财2，孟凤丽1，王爱萍1

1.郑州大学 生命科学学院，河南 郑州 450001；

2.河南省农业科学院 动物免疫学重点实验室，河南 郑州 450002

目的：采用分子伴侣pTf16共表达的形式促进截短型人乳头瘤病毒（HPV）58亚型L1蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达。方法：将重组表达质粒pGEX-6P-HPV58-L1转入含有分子伴侣pTf16的大肠杆菌BL21感受态细胞中，在2.0 mg/m L L-阿拉伯糖诱导表达20 min之后加入1.0 mmol/L的IPTG，18℃诱导表达24 h，使目的蛋白与伴侣蛋白共表达；重组蛋白经GST亲和纯化后去除GST标签免疫昆明鼠，ELISA检测免疫血清效价。结果：分子伴侣pTf16能显著提高目的蛋白的可溶性表达，经纯化及去除GST标签，用SDS-PAGE与Western印迹检测，约在相对分子质量50×103处出现特异性反应条带，该条带与截短型HPV58 L1蛋白预期大小相符，免疫动物后经ELISA检测小鼠血清的抗体效价为1∶6400。结论：获得了截短型HPV58 L1蛋白，动物免疫试验证实该蛋白具有较好的免疫原性，为进一步研制HPV58预防型疫苗奠定了基础。

人乳头瘤病毒58亚型；截短型L1蛋白；伴侣分子pTf16

1933年Shope在绵尾兔（Lepus timidus）体内首次发现兔乳头瘤病毒（cottontial rabbit papillomavirus，CRPV），随后相继在人和许多哺乳动物体内发现了乳头瘤病毒[1]。1974年zur Hansen提出生殖上皮非典型增生与宫颈癌的发生都与人乳头瘤病毒（human papillomavirus，HPV）的感染密切相关[1]。目前，研究证实HPV的感染是宫颈上 皮 内 瘤 变（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）和宫颈癌的主要诱导因素[2]。HPV亚型约有200余种，其中能引起生殖道感染的约40种[3]。HPV16和HPV18是全球最常见的感染型别，而HPV58在东南亚地区宫颈病变中的感染率又很高[4]。研究显示，我国上海、香港和台湾HPV58在宫颈鳞状细胞癌中的检出率分别为26%、10%、10%，在韩国和日本分别为16%和8%[5]。

HPV属于乳头瘤病毒科（Papillomaviridae）[6]，是一种无膜包被的双链环状DNA病毒，基因组全长约8000 bp，其编码区可分为早期区（E区）和晚期区（L区）[7]。病毒主要衣壳蛋白L1为晚期区编码蛋白，具有相对较高的保守性，可以刺激机体产生长效的中和抗体，因此，L1蛋白是研制预防型疫苗的首选靶标[8-9]。目前已上市的疫苗主要是酵母表达系统或杆状病毒表达系统制备的L1蛋白病毒样颗粒（VLP）疫苗，但这2种表达系统技术复杂且成本高，不适于在发展中国家推广使用，所以人们一直在尝试发展新的廉价的HPV疫苗。大肠杆菌表达系统具有生产成本低、生产效率高、操作简单等优点，一直受到人们的青睐，然而大量研究显示HPV L1蛋白在大肠杆菌中的表达多以包涵体形式存在，仅有少数有可溶性表达，但表达量不高[9]。研究显示，截短型HPV L1蛋白的表达量较之全长型L1蛋白的表达量高[4]，且一定形式的截短型L1蛋白并不影响其免疫活性[10]。外源蛋白在原核细胞中表达时易形成包涵体，而分子伴侣能够促进目的蛋白的可溶性表达，减少包涵体的形成，提高目的蛋白的活性[11]。因此，我们以HPV58 L1蛋白作为研究对象，将其N端缺失10个氨基酸残基并用GGSGG替代，同时缺失C端23个氨基酸残基，把L1蛋白第403～435区域缺失突变用GGSGG取代以增加目的蛋白的可溶性，并在N端增加GST-Tag以便于目的蛋白的纯化及鉴定。构建了包含上述截短型HPV58 L1蛋白编码基因的原核表达载体pGEX-6PHPV58-L1，同时采用与分子伴侣共表达的方式来促进截短型HPV58 L1蛋白在大肠杆菌中的高效表达，为进一步研制HPV58亚型疫苗奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

4～6周龄SPF级雌性昆明小鼠购自河南省医学实验动物中心，由河南省农业科学院动物免疫学重点实验室动物房饲养；截短型HPV58 L1蛋白载体质粒pGEX-6P-HPV58-L1及全长HPV58 L1蛋白表达菌种pESUMO-HPV58-L1由河南省农业科学院动物免疫学重点实验室保存；伴侣蛋白质粒pTf16购自大连宝生物工程有限公司（TaKa-Ra）；感受态大肠杆菌BL21（DE3）购自天根生化科技有限公司。

质粒提取试剂盒购自大连宝生物工程有限公司（TaKaRa）；IPTG、HRP标记的IgG购自华美公司；AEC酶底物试剂盒购自中山金桥公司；氨苄西林（Amp）、氯霉素（Cm）购自哈药集团；3，3'，5，5'-四甲基联苯胺（TMB）购自Sigma公司；GST柱子购自GE公司。

1.2 分子伴侣共表达菌株的构建

将伴侣蛋白质粒pTf16转化大肠杆菌感受态细胞BL21，并制备感受态细胞，随后将1μL阳性质粒pGEX-6P-HPV58-L1加入100μL制备好的含分子伴侣的感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴中静止30 min，42℃水浴中静止60～90 s，轻轻取出放入冰中静置2 min，向其中加入500μL LB培养液，37℃、220 r/min振荡培养1 h，4℃、4000 r/ min离心4 min，弃去部分上清，留下100μL将菌体重悬后用无菌弯头玻璃棒涂布于Amp+/Cm+的固体培养基，倒置于37℃恒温培养箱中过夜，挑选6个单克隆于Amp+/Cm+双抗液体培养基中，37℃、220 r/min振荡培养14 h，保存菌种，提取质粒，进行核酸电泳鉴定。

1.3 伴侣分子pTf16与目的蛋白的共表达

分别将含有分子伴侣与不含分子伴侣的菌体按1∶1000接种于Amp+/Cm+或Amp+LB培养液中，37℃、220 r/min过夜培养活化，将活化菌体按1∶100接种于新鲜的相应抗性的LB培养液中，37℃、220 r/min培养2 h，待D600nm达0.6左右，分别对伴侣分子和HPV58 L1蛋白进行诱导表达。首先，加入终浓度为2 mg/mL的诱导剂L-阿拉伯糖，37℃、220 r/min继续培养20 min；之后加入终浓度为1.0 mmol/L的诱导剂IPTG，18℃、220 r/min振荡培养24 h；不含分子伴侣的重组表达菌只加入终浓度为1.0 mmol/L的IPTG诱导表达；将诱导后的样品分别进行超声波破碎（30%的全功率，超声3 s，暂停5 s，工作时间为10 min），12 000 r/ min离心15 min，分别收集上清和沉淀进行SDSPAGE分析。

1.4 共表达条件的优化

分别对IPTG浓度、L-阿拉伯糖浓度及L-阿拉伯糖诱导时间等共表达条件进行优化。将过夜活化的共表达菌液1∶100接种到Amp+/Cm+LB培养液中，37℃、220 r/min培养2 h，待D600nm达0.6左右，加入终浓度为2 mg/mL的L-阿拉伯糖，37℃、220 r/min继续培养20 min；再分别加入终浓度为0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L的IPTG，18℃、220 r/min培养24 h，分析不同浓度IPTG对目的蛋白表达情况的影响；待经活化的菌液D600nm达0.6左右，加入终浓度分别为0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、2、3 mg/mL的L-阿拉伯糖，37℃、220 r/min培养20 min；加入终浓度为1.0 mmol/L的IPTG，18℃、220 r/min振荡培养 24 h，分析不同浓度L-阿拉伯糖对目的蛋白表达情况的影响；待经活化的菌液D600nm达0.6左右，加入终浓度为2 mg/mL的L-阿拉伯糖，37℃、220 r/min分别培养0、5、10、15、20、25、30 min；加入终浓度为1.0 mmol/L的IPTG，18℃、220 r/min振荡培养24 h，分析加入L-阿拉伯糖不同时间后再加入IPTG对目的蛋白表达情况的影响；最后将诱导后的样品分别进行超声波破碎（30%的全功率，超声3 s，暂停5 s，工作时间为10 min），12 000 r/min离心15 min，分别收集上清和沉淀进行SDS-PAGE分析。

1.5 目的蛋白的纯化

收集经诱导表达的重组菌体，重悬后超声波破碎，12 000 r/min离心15 min，收集上清，经GST亲和层析柱纯化，收集洗脱液，进行12%的SDS-PAGE分析，将洗脱液于4℃透析，测定蛋白含量，用Prescission Protease酶切，酶切后的蛋白再经GST亲和层析柱纯化去除GST标签，收集上样后的流出液，分别进行12%的SDS-PAGE及Western印迹鉴定。

1.6 重组蛋白HPV58 L1的免疫评价

1.6.1 免疫昆明鼠 取纯化获得的HPV58 L1蛋白，按200μL/只经背部皮下多点注射免疫昆明小鼠。分为3组，第1组免疫剂量为40μg，第2组免疫剂量为20μg，第3组为PBS对照组；共免疫3次，免疫间隔3周，首免等比例加入弗氏完全佐剂，后2次免疫等比例加入弗氏不完全佐剂。免疫后0、21、28、35 d断尾采血；三免后2周，将小鼠摘眼球取血，3000 r/min离心5 min收集血清，测定效价。

1.6.2 ELISA测定抗体效价 用碳酸盐缓冲液将纯化的带有SUMO标签的HPV58 L1蛋白稀释至2μg/mL，按50μL/孔加入96孔ELISA板内，4℃包被过夜；PBST（PBS+0.5%吐温-20）洗5次，每孔加入200μL 5%的脱脂奶，37℃封闭2 h；PBST洗3次，第一孔按1∶200加入100μL待检血清，第2～12孔分别加入50μL PBS，取出第1孔50 μL血清加入第2孔充分混匀，按1/2梯度稀释至第11孔，弃去50μL，37℃孵育1 h，PBST洗5次；每孔加入 50μL HRP标记的羊抗鼠 IgG（1: 5000），37℃孵育30 min，PBST洗5次；加入显色液，室温条件下显色8 min，之后加入2 mol/L硫酸终止显色，测定D450nm值。

2 结果

2.1 分子伴侣与目的基因共表达载体的构建

提取共表达菌质粒电泳鉴定，结果显示2、4、5号既含有目的蛋白质粒也含有伴侣蛋白质粒，说明共表达载体构建成功（图1）。

2.2 分子伴侣与目的基因共表达产物的鉴定

分别将含或不含分子伴侣的重组表达菌体进行诱导表达，SDS-PAGE结果显示含有分子伴侣的菌体超声波上清明显可见相对分子质量为72×103的目的条带和55×103的伴侣蛋白条带，大小与预期一致，而沉淀中几乎无目的蛋白；而不含分子伴侣的菌体超声波上清中几乎无目的蛋白，沉淀中明显可见72×103的目的条带（图2）。说明分子伴侣能显著提高目的蛋白的可溶性表达，有效减少了包涵体的形成。

2.3 共表达条件的优化

图1 共表达菌质粒的电泳鉴定

图2 分子伴侣与目的基因共表达产物的SDS-PAGE鉴定

分别对IPTG浓度、L-阿拉伯糖浓度及L-阿拉伯糖诱导时间等共表达条件进行优化，结果显示，随着IPTG浓度的提高，目的蛋白可溶性表达量有一定升高，故选择1.0 mmol/L为IPTG最终诱导浓度（图3A）；而伴侣蛋白诱导剂L-阿拉伯糖浓度（图3B）及加入时间（图3C）对目的蛋白的影响不大，从SDS-PAGE结果可以看出在2.0 mg/mL的L-阿拉伯糖条件下目的蛋白可溶性表达量相对较高。故选择37℃、220 r/min、2.0 mg/mL的L-阿拉伯糖诱导20 min后，加入终浓度为1.0 mmol/ L的诱导剂IPTG，18℃、220 r/min振荡培养24 h作为最适诱导表达条件。

2.4 目的蛋白的纯化及GST标签的切除

纯化后的目的蛋白经SDS-PAGE与Western印迹分析，结果显示Prescission Protease可以有效切除GST标签。经纯化后去除GST标签，截短型HPV58 L1蛋白相对分子质量约50×103，与预期重组蛋白大小相符，纯度可达90%以上（图4）。

2.5 血清抗体效价的测定

图3 目的蛋白的诱导表达条件优化

ELISA结果显示，不同小鼠个体间免疫应答水平存在一定差异，40μg免疫剂量组小鼠血清抗体效价基本上都能达到1∶6400，20μg免疫剂量组小鼠血清抗体效价为1∶1000～1∶3200，而PBS对照组均无特异性抗体产生（图5A）。经Graph-Pad Prism 5软件分析，与PBS对照组相比，40μg或20μg免疫剂量组均具有显著性差异，40μg与20μg免疫剂量组之间差异不显著（图5B）。

3 讨论

图4 酶切前后目的蛋白的SDS-PAGE（A）及Western印迹（B）

图5 ELISA测定免疫血清效价

HPV主要衣壳蛋白L1能形成五聚体的子粒，HPV衣壳由72个子粒构成[12]。目前上市的预防性疫苗主要是针对L1蛋白的VLP疫苗[13]，HPV L1蛋白作为疫苗已被实践所证实。目前的L1蛋白疫苗主要来自酵母表达系统或杆状病毒表达系统，也有大量研究集中在原核表达系统，但大肠杆菌中表达的L1蛋白多以包涵体形式存在，可溶性表达量不高。已有研究表明截短型HPV L1蛋白表达量高于未截短的L1蛋白表达量[14-15]，且如N端10个氨基酸的缺失或C端部分氨基酸的缺失等的截短型HPV L1蛋白仍能保持其生物学活性[10,16]。另外，Xu等的最新研究显示HPV58 L1蛋白N端1～35位及C端403～435位氨基酸并不包含潜在的B细胞表位，C端也不包含关键的抗原表位[17]。我们将HPV58 L1蛋白N端10个氨基酸、403～435区域及C端23个氨基酸进行缺失，研究截短型HPV58 L1蛋白在大肠杆菌中的表达及其免疫原性。为了提高蛋白在大肠杆菌系统内的可溶性表达，常用方法有降低诱导表达温度、加入分子伴侣或融合蛋白与目的蛋白共表达[18]、加入化学物质山梨醇[19]等。本实验采用分子伴侣pTf16与目的蛋白共表达的方法，分析伴侣蛋白pTf16对目的蛋白可溶性表达的影响，结果表明pTf16能显著提高带有GST标签的截短型HPV58 L1蛋白的可溶性表达，有效减少包涵体的形成。经酶切纯化除去GST标签后，获得较高纯度的截短型HPV58 L1蛋白，动物实验证实无论40μg还是20μg的免疫剂量，与PBS阴性对照组相比，血清抗体效价均呈显著性差异，表明该截短型HPV58 L1蛋白具有良好的免疫原性。

综上所述，本研究以带有GST标签的目的蛋白与分子伴侣共表达的形式，显著提高了目的蛋白的可溶性表达量；经过纯化、GST标签去除，最终获得纯度达90%的目的蛋白，动物实验初步证实该截短型HPV58 L1蛋白具有较高的免疫原性，为后期HPV疫苗的研制奠定基础。

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Recombinant Expression of Truncated Human Papillom avirus 58 L1 Protein with Molecular Chaperones in E.coli

RAN Yun-Wei1,ZHANG Gai-Ping2,LIU Yun-Chao2, CHEN Yu-Mei1,WANG Ju-Cai2,MENG Feng-Li1,WANG Ai-Ping1*

1.School of Life Science,Zhengzhou University,Zhengzhou 450001;
2.Key Laboratory of Animal Immunology,Henan Academy of Agricultural Sciences,Zhengzhou 450002;China

*Corresponding authors,E-mail:pingaw@126.com

Objective:To improve the soluble expression efficiency of truncated human papillomavirus（HPV）type 58 L1 protein inE.colithrough the co-expression with molecular chaperone pTf16.Methods:The recombinant expression plasmid,pGEX-6P-HPV58-L1,was transferred into the competence ofE.coliBL21 containing pTf16,to construct prokaryotic co-expression vector.The best inducing conditions of recombinant protein were,at 18℃ for 24 h with 2.0 mg/mL L-arabinose and 1.0 mmol/L IPTG.The recombinant protein GST-HPV58-L1 was obtained and purified with GST affinity column using one-step protocol.After cleavage of GST-Tag,the truncated HPV58 L1 proteins were used to immunize Kunming-mice to acquire antiserum,and antiserum was analysed by ELISA.Results:Molecular chaperone pTf16 can significantly improve the soluble expression efficiency of truncat-ed HPV58 L1 protein inE.coli.The truncated HPV58 L1 protein was identified by SDS-PAGE and Western blot and showed a specific band at about 50 kD.The results of ELISA showed that the antiserum had the high titer（1∶6400）.Conclusion:The truncated HPV58 L1 was successfully obtained and with high immunogenicity,which laid the foundation for further development of HPV58 preventive vaccine.

human papillomavirus（HPV）type 58;truncated L1 protein;molecular chaperone pTf16

Q78

A

1009-0002（2017）03-0295-06

10.3969/j.issn.1009-0002.2017.03.011

2016-12-06

河南省高校科技创新团队和创新人才支持计划（14HASTIT027）

冉云伟（1990-），男，硕士研究生，（E-mail）1375530798@qq.com

王爱萍，（E-mail）pingaw@126.com