生物技术药物生物学活性测定方法研究进展

于雷，饶春明

中国食品药品检定研究院，北京 100050

生物技术药物生物学活性测定方法研究进展

于雷，饶春明

中国食品药品检定研究院，北京 100050

生物技术药物的活性测定在质量控制中至关重要。目前的生物活性分析方法主要包括体内（动物）和体外（细胞）实验。基于细胞的活性测定方法由于其具有操作简便、周期短、成本低、高通量、变异度小等优点，正广泛地替代动物实验。为了获得强反应性的细胞系和简便易行的检测方法，构建转基因细胞系成为较好的选择。本综述主要论述了生物技术药物活性测定方法的现状及发展趋势，概括了基于细胞系的活性测定方法的种类和检测方法，以及转基因细胞系的应用进展。

生物学活性测定；动物实验；转基因细胞系；报告基因法

生物技术药物，如细胞因子、激素、单抗和其他重组蛋白类药物，是一类快速增长的药物，正越来越广泛地应用于临床。由于生物技术药物的分子异质性，其理化特性较小分子化合物复杂，在质量控制中不仅要检定其理化性质，还要对其生物学活性进行检测[1-2]。生物活性测定是测定药物对机体的生物学效应，在新药开发和药物质量控制中发挥重要作用。

早期的生物活性测定主要依赖于动物实验，通过检测药物对实验动物的药效反应来反映其生物学活性。动物模型是最能够真实有效反映药物临床药理效用的方式，但是它存在着一些缺点：定量难，动物个体差异大，动物饲养成本高，实验周期长，操作繁琐，伦理学问题等。体外组织分离实验缩短了动物实验的周期，定量相对比较准确，但是仍不能克服其他缺点。而细胞实验不仅操作方便、定量准确、变异度小，且成本低，正广泛应用于药物的活性测定领域。随着分子细胞生物学技术和信号通路研究的发展，基于转基因细胞系的生物活性测定方法越来越受到人们的关注。表1概括了生物活性分析方法及其特点，下面对各类方法进行分别讨论。

1 体内动物实验

动物实验是通过检测药物对实验动物的药效作用来反映其生物学活性。早期的生物活性测定主要依赖于动物实验，目前多数被细胞实验代替。对于一些作用机制复杂的药物，目前仍需要借助于动物实验。例如，促红细胞生成素（EPO）是多糖蛋白，糖链结构决定了体内半衰期，后者与其药效作用密切相关，因此体外法不能完全替代体内法来反映其药效作用，EPO的生物学活性测定方法仍主要依赖于体内实验——网织红细胞计数法。具体做法是给小鼠皮下注射EPO后，其网织红细胞数量随EPO剂量的增加而升高，利用网织红细胞数对红细胞数的比值变化，通过剂量反应平行线法检测EPO体内生物学活性。内皮抑素具有抑制肿瘤血管形成的作用，但具体作用机制比较复杂，目前主要通过检测其对荷瘤小鼠动物模型肿瘤生长的抑制能力进行活性测定。还有一些药物，尽管已有研究报道了基于细胞系的测活方法，尚未进行全面的适用性研究，其常规测定仍然借助于动物实验，例如，重组人骨形成蛋白2（小鼠体内异位成骨试验）[3-4]、重组人生长激素（去垂体大鼠体重法/去垂体大鼠胫骨法）、重组人胰岛素（小鼠血糖测定法）。

2 体外组织实验

体外组织实验缩短了动物实验周期，定量相对准确，但仍依赖于实验动物，不能克服动物个体差异带来的变异度大等缺点，目前基本被细胞实验所替代。例如，B型利钠肽（BNP）的早期测活方法为家兔主动脉法，具体做法是分离兔主动脉条，加入一定浓度的肾上腺素刺激其收缩，再检测rhBNP作用后动脉条的张力变化来反映其生物学活性[5]。该方法操作复杂，且变异度大，目前已被细胞法代替[6-7]。神经生长因子（NGF）的早期测活方法为鸡胚背根神经节法，通过检测NGF对分离培养的鸡胚背根神经节的促生长作用来测定其活性，近年也被TF1细胞增殖法代替[8-10]。

3 基于细胞系的生物活性分析方法

随着药物高通量筛选平台的建立和生产规模的扩大，依赖于实验动物的活性分析方法已经不能满足需求。而基于细胞系的生物活性分析方法由于其高通量、高效率、高精确度等优势，越来越受到研究者和生产商的青睐[2,11-15]。虽然单一的细胞学效应能否完全代替动物实验来评价药物的生物学活性至今仍是比较有争议的话题，但是从目前的发展趋势来看，细胞实验正越来越多地取代动物实验。一般生物药物如细胞因子的作用机制是结合并激活其特异性受体，通过信号转导和传递，最终发挥细胞学效应。目前基于细胞系的生物学活性测定方法正是基于药物的作用机制。从检测的细胞学效应来看，目前主要有以下4种类型。

3.1 上游效应

主要检测特异受体的激活程度。多数细胞因子类药物的受体都是磷酸化受体，被配体激活后会发生磷酸化，通过检测受体的磷酸化程度来测定药物激活其受体的能力，间接反映药物的生物学活性[16]。这种方法变异度低，且耗时短，但是需要抗磷酸化受体的特异性抗体，使其应用受到限制。

3.2 中间效应

主要检测信号分子的浓度。信号分子包括cAMP、cGMP、Ca2+等，在药物作用的信号传递中发挥重要作用，其浓度的升高或降低间接反映了药物的生物学活性，但信号分子的检测需要特定的检测试剂盒。

3.3 下游效应

主要检测下游基因表达的激活或抑制。例如IL-12可以刺激外周血淋巴细胞分泌IFN-γ，通过测定IFN-γ的分泌量来反映其活性[17]。

3.4 表型效应

检测药物对细胞的整体效应，如增殖、凋亡、迁移等，是最常用的检测方法。很多生长因子的活性测定是通过其对靶细胞的促增殖作用来实现的，例如表皮生长因子（EGF）、成纤维细胞生长因子（FGF）、粒细胞集落刺激因子（G-CSF）、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）。而某些肿瘤杀伤性药物是通过其对肿瘤细胞的杀伤作用来测定其生物学活性的，例如肿瘤坏死因子（TNF）。

表1 生物活性分析方法

4 转基因细胞系在生物活性测定中的应用

由于很多生物技术药物没有强反应性的细胞系，或者没有易检测的细胞学效应，构建转基因的细胞系成了很好的选择。构建药物反应性转基因细胞系是依据药物的作用机制来制定方案的。首先应该全面深入地研究药物的作用机制，包括受体激活、信号转导、信号传递及终效应，选择合适的靶标作为药物活性测定的指标。报告基因法[13]是目前比较常见的转基因细胞系活性测定方法，该方法的原理是：药物作用于细胞后，通过信号通路最终激活或失活特定的转录因子，从而引起某些基因的表达提高或降低。将转录因子的特定DNA反应元件插入报告基因的启动子区，并导入药物反应性细胞，通过检测药物作用后报告基因表达的变化来测定药物的生物学活性[2]。除了报告基因法，还有多种改造细胞系应用于活性测定。从目前文献报道来看，根据细胞改造方式的不同，主要分为以下几类：

4.1 只导入报告基因

对于某些有强反应性细胞系，且能够强激活或失活转录因子的药物，仅仅需要转入报告基因便可满足检测需求[18-19]。如IFN与其受体结合后可以引起转录因子stat3/stat5激活，后者作用于干扰素反应元件ISRE，激活下游基因的表达。本科室前期与加拿大卫生部合作建立了干扰素报告基因测活方法，向293细胞内转入ISRE萤光素酶报告基因，可以有效地进行IFN活性测定，该方法现已收入2015版《中国药典》（三部），作为干扰素活性测定第二法[18]。

4.2 只导入天然受体

对于某些药物没有强反应性的细胞系，需要转入天然受体，增强细胞对该药物的反应性。如本科室前期建立了一种BNP测活新方法：将天然受体GCA表达载体转染HEK293细胞，构建GCA超表达的转基因细胞，该细胞在受到rhBNP刺激后，分泌至细胞上清的cGMP水平增加，然后通过竞争ELISA法检测cGMP的变化来测定rhBNP的生物学活性[6-7]。

4.3 导入天然受体和报告基因

某些药物既没有强反应性细胞系，又没有易检测的细胞效应，但是信号通路明确，可以激活特定的DNA反应元件。这种情况可以通过同时导入其天然受体和报告基因来解决[12]。本科室前期将促胰岛素分泌肽天然受体（GLP-1R）和cAMP萤光素酶报告基因同时导入CHO-K1细胞，建立了促胰岛素分泌肽融合蛋白的报告基因测活方法，成功应用于该类品种的活性测定[20-21]。

4.4 导入融合受体

对于某些没有易检测的细胞学效应的药物，可以通过导入融合受体来检测其生物学活性。例如，B细胞活化因子（BAFF）受体的胞外区与TRAIL-R-2的胞内区融合，导入横纹肌肉瘤细胞，改造的细胞系经 BAFF刺激后，可激活TRAIL-R-2胞内区的死亡结构域，引起细胞死亡，用来检测BAFF的生物学活性[22]。

4.5 导入融合受体和报告基因

例如血管内皮生长因子抑制剂的活性测定方法，向293细胞内导入融合受体VEGFR-IL-8R和NF-κB报告基因，VEGFR-IL-8R由VEGFR的胞外区和IL-8R的胞内区组成，VEGF与之结合后可激活IL-8R的胞内区，经过IL-8的信号传递过程激活NF-κB报告基因，通过测定血管内皮生长因子抑制剂抑制VEGF激活报告基因的能力来反映其生物学活性[23]。

5 生化分析方法

除了动物实验和细胞实验，目前还出现了不依赖细胞的生化分析方法，包括免疫分析和受体结合分析[2]等，某些单抗制品可以通过ELISA来测定其与抗原的结合活性来间接反映其生物学活性，如VEGF单抗[3]。但是这种单一的结合能力能否代表生物学活性仍存在争议，通常还须结合其他细胞实验或动物实验来验证其适用性。

6 结语

分子生物学的快速发展和细胞信号通路的深入研究，促进了基于细胞系的生物活性测定方法的发展。从目前的发展趋势来看，如何寻求一种最有效反映药物生物学活性的细胞实验来替代动物实验，已经成为生物药物质量控制工作中的重要环节。而细胞实验的方法验证需要结合动物实验来进行适用性研究，只有能够真实可靠地反映药效作用的实验方法才能应用于药物的活性测定。

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Research Progress in Bioassay of Biotech Drugs

YU Lei,RAO Chun-Ming*

National Institutes for Food and Drug Control,Beijing 100050,China

*Corresponding author,E-mail:raocm@nifdc.org.cn

The bioassay is essential in quality control of biological therapeutics.Classical bioassay includes animal test and cell test.Cell-based bioassay is replacing animal test,because of its advantages,such as simple operation,short processing cycle,low cost,high flux,and small variation.To obtain strong-responsive cell line and easy-operating analytical method,constructing modified cell line is a good choice.This review mainly discussed the situation and trend of biological therapeutics bioassay,and generalized types and methods of cell-based bioassay,and application of modified cell lines.

bioassay;animal test;modified cell line;report gene assay

Q78

A

1009-0002（2017）03-0392-05

10.3969/j.issn.1009-0002.2017.03.030

2017-04-21

于雷（1984-），女，助理研究员，（E-mail）yulei@nifdc.org.cn

饶春明，（E-mail）raocm@nifdc.org.cn