miR-216b在体外培养细胞中加速长非编码RNA UCA1的降解

郑伟，郭晓华，董洁，李少华，丁红梅，李慧，黄皑雪，夏伟，白琛俊，李达，耿介，李洁，邵宁生

军事医学科学院 基础医学研究所，北京 100850

miR-216b在体外培养细胞中加速长非编码RNA UCA1的降解

郑伟，郭晓华，董洁，李少华，丁红梅，李慧，黄皑雪，夏伟，白琛俊，李达，耿介，李洁，邵宁生

军事医学科学院 基础医学研究所，北京 100850

目的：探讨长非编码RNA（lncRNA）UCA1作为miR216b的“分子海绵”结合miR-216b后的命运变化。方法：提取人HEK293T细胞基因组，以特异性引物PCR扩增UCA1基因并克隆至pcDNA6.0b载体，用氨苄西林抗性筛选阳性克隆，重组质粒pcDNA6-UCA1转染HEK293T和HeLa细胞并鉴定其表达水平。向HEK293T和HeLa细胞转染miR-216b类似物，同时用放线菌素D抑制细胞转录，收取3个时间点的细胞总RNA并鉴定其完整性，反转录获得cDNA后，采用实时荧光定量PCR技术检测各时间点UCA1的水平，测定其半衰期。pcDNA6-UCA1转染细胞24 h后，转染miR-216b类似物或miR-216b抑制剂，并使用放线菌素D抑制转录，收取3个时间点的细胞总RNA，qRTPCR检测UCA1半衰期。结果：构建的pcDNA6-UCA1过表达质粒转入HEK293T细胞后，qRT-PCR检测UCA1表达水平显著提高；miR-216b能够降低细胞内源或外源过表达的UCA1稳定性，加速UCA1的降解，显著缩短其半衰期；使用miR-216b的抑制剂，UCA1的半衰期延长。结论：miR-216b能够加速lncRNA-UCA1的降解，为研究miRNA与lncRNA的相互作用提供了新的思路。

UCA1；长非编码RNA；miR-216b；降解

microRNA（miRNA）是一类长度为22 nt左右的非编码小RNA，其可通过碱基互补配对的方式与 mRNA的3'端非翻译区（untranslated region，UTR）结合，导致mRNA的剪切降解或抑制mRNA的翻译，进而调控靶基因的表达[1-3]。miRNA参与细胞分裂增殖、分化和机体发育及物质代谢等多种极其重要的生物学过程[3]。迄今，已确定了超过3700个具有统计学意义的人成熟miRNA，并获得了3494个新的前体，而且新发现的miRNA数量还在不断上升，相信未来将会有更多的miRNA及其靶基因被鉴定出来[4]。

长非编码 RNA（long non-coding RNA，lncRNA）指的是长度大于200 nt，不编码蛋白质的一类非编码RNA[5]。近年来，随着研究的深入，人们发现lncRNA能够在表观遗传学、转录水平、转录后水平等多个层面对基因的表达进行调控，从而通过多种机制发挥其生物学功能。已有研究报道显示，lncRNA对细胞分化、迁移及增殖等过程的调控起到相当重要的作用[6]。自lncRNA被发现可以作为miRNA的“分子海绵”后，它与miRNA之间的关系逐渐引起了人们较大的研究兴趣。lncRNA能够通过与互补miRNA结合，抑制后者对miRNA靶基因的沉默效应，但lncRNA与互补miRNA结合后的自身命运变化鲜有报道。

有报道，作为一种肿瘤抑制miRNA，miR-216b在咽喉癌和肝细胞肝癌中能够起到抑癌作用。miR-216b能够通过调控K-ras基因的表达，抑制鼻咽癌、肝细胞肝癌细胞的增殖和侵袭，及细胞周期的阻滞[7-8]。

尿路上皮癌抗原1（urothelial carcinoma associated 1，UCA1）最早是由Wang等在膀胱癌细胞中鉴定的高表达的lncRNA，并命名为UCA1[9]。研究发现，UAC1在膀胱癌、宫颈癌、食管癌、结直肠癌、卵巢癌、黑色素瘤和胰腺癌等多种恶性肿瘤中均有异常高表达，而在正常组织中表达量低或不表达[10-15]，表明UAC1有成为肿瘤标志物的可能性。此外，UCA1还被证明具有作为miR-216b的“分子海绵”的功能，通过与miR-216b结合，减弱miR-216b的功能，从而影响miR-216b的靶基因成纤维细胞生长因子受体1（fibroblast growth factor receptor 1，FGFR1），进而调控FGFR1所参与的ERK信号通路[8]。

lncRNA-UCA1能够通过与miR-216b结合，抑制miR-216b对靶基因的沉默效应，但UCA1结合miR-216b之后的自身命运变化尚无报道。我们通过构建UCA1的过表达质粒并转染细胞，并通过转染miR-216b mimic和miR-216b inhibitor，利用实时荧光定量PCR检测了UCA1的半衰期，为进一步研究UCA1与miR-216b相互作用的确切分子机制奠定了基础。

1 材料和方法

1.1 材料

HEK293T和HeLa细胞株、pcDNA6.0b载体由本室保存；DMEM培养基购自Gibco公司；TRIzol试剂购自Sigma公司；反转录酶购自Promega公司；dNTP、T4DNA连接酶、基因组提取试剂盒购自天根公司；RNA酶抑制剂、Phusion DNA扩增酶、限制性内切酶、切胶回收和质粒提取试剂盒购自Thermo公司；实时荧光定量检测试剂SYBR Green mix购自Toyobo公司；琼脂糖购自Lonza公司；Tris base和甘氨酸购自Novon公司；PCR引物、反转录引物和qPCR引物由上海生工公司合成；miR-216b mimic及对照、miR-216b inhibitor及对照由广州锐博公司合成。

1.2 pcDNA6-UCA1重组质粒的构建与测序

提取HEK293T细胞的基因组，以其为模板，用上游引物UCA1-F1（5'-CGGAATTCGATCTCTC CTCTTCCTCCTGGAAGC-3'）和下游引物UCA1-R1（5'-CCGCTCGAGAGGAAGATTTCTTTTCTGTCACC T-3'）扩增UCA1基因[6]。PCR扩增条件：预变性98℃ 30 s；变性98℃ 10 s，退火62℃ 30 s，延伸72℃ 1 min，35个循环；终延伸72℃ 5 min。PCR产物通过1%琼脂糖电泳后切胶回收，和载体pcDNA6.0b分别用EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切，回收酶切产物，用T4DNA连接酶连接目的基因与载体，16℃连接过夜；连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，培养过夜，挑选单克隆菌落接种于1 mL含50 mg/L氨苄西林的培养基，37℃培养6 h，菌液PCR鉴定克隆，将鉴定得到的阳性克隆送奥科鼎盛生物科技有限公司测序。

1.3 细胞转染

将HEK293T细胞接种于12孔板中，24 h后取1μg pcDNA6、pcDNA6-UCA1质粒稀释于100 μL无血清 DMEM中，分别与含 3μL LipofectAMINE 2000转染试剂的 100 μL无血清DMEM培养基混合，室温孵育20 min后加入相应的细胞培养孔中，培养5 h后更换含10%胎牛血清的培养基继续培养48 h。

将生长良好的HeLa细胞和HEK293T细胞接种于12孔板中，于37℃、5%CO2条件下培养24 h；按LipofectAMINE 2000说明书将50 pmol miR-216b mimic及对照分别稀释于100μL无血清DMEM培养基中，与含3μL LipofectAMINE 2000的100μL无血清DMEM培养基混合，室温孵育20 min后加入相应的细胞培养孔中，同时用终浓度为10μg/mL的放线菌素D抑制细胞转录，分别收取3个时间点的细胞总RNA待检测。

接种状态良好的HEK293T和HeLa细胞于12孔板中并培养24 h，将0.5μg pcDNA6-UCA1稀释于100μL无血清DMEM中，与含3μL LipofectAMINE 2000的100μL无血清DMEM培养基混匀，室温孵育20 min后加入相应的细胞培养孔中，培养5 h后更换含10%胎牛血清的培养基继续培养24 h，将50 pmol miR-216b mimic及对照或100 pmol miR-216b inhibitor及对照分别稀释于100μL无血清DMEM培养基中，与含3μL LipofectAMINE 2000的100μL无血清DMEM培养基混合，室温孵育20 min，将混合液加入相应的细胞培养孔中，同时用终浓度为10μg/mL的放线菌素D抑制细胞转录，收取细胞总RNA。

1.4 RNA提取及其完整性鉴定

按TRIzol试剂说明书提取细胞总RNA后稀释至1/50，在紫外分光光度计上检测RNA的浓度以及D260mm/280mm值。取1μg RNA，用1%琼脂糖电泳鉴定RNA的完整性。

1.5 细胞总RNA逆转录

取1μg细胞总RNA，加入1μL oligo（dT），用DEPC水补至13μL，混匀后70℃热变性5 min，立即置于冰上退火，加入7μL混合物（5×MMLV缓冲液4μL，dNTP 2μL，M-MLV逆转录酶0.5μL，RNase抑制剂0.5μL），42℃反应90 min，95℃灭活酶5 min，置于-20℃备用。

1.6 实时荧光定量PCR

用Stratagene公司的Mx3000P qPCR仪检测UCA1 mRNA水平。反应体系包括1μL cDNA、1μL特异引物（表1）、2×qPCR SYBR Green mix 10μL、ddH2O 8μL。反应条件：预变性95℃ 3 min，变性95℃ 15 s，退火56℃ 20 s，延伸72℃ 20 s，40个循环。采集熔解曲线，用Mx3000P软件分析结果。

2 结果

2.1 lncRNA-UCA1含有miR-216b结合位点

用生物信息学软件预测，结果显示lncRNAUCA1含有miR-216b的潜在结合位点（图1），同时结合相关文献报道，萤光素酶实验显示共转染miR-216b和UCA1萤光素酶载体后，萤光素酶活性出现显著抑制[8]。因此，UCA1能够与miR-216b结合。

2.2 UCA1基因的PCR扩增

以提取的HEK293T细胞基因组（图2）为模板，用Phusion酶PCR扩增35个循环得到目的片段，1%琼脂糖电泳分析表明，得到的扩增片段与预期1615 bp大小一致（图3），用切胶回收试剂盒对PCR产物进行纯化。

表1 实时荧光定量PCR所用引物序列

图1 生物信息学预测lncRNA-UCA1含有miR-216b结合位点

2.3 pcDNA6-UCA1表达载体的构建与鉴定

用EcoRⅠ和XhoⅠ分别对纯化后的扩增片段和pcDNA6.0b双酶切，将酶切片段与酶切质粒用T4DNA连接酶连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，37℃培养过夜，挑选单克隆，在含氨苄西林的LB培养基中培养6 h，以菌液为模版进行PCR扩增鉴定，电泳结果显示2、4、5号菌液与预期相符（图4）。将2、4、5号菌液送公司测序，序列与目的基因进行比对，结果无误，表明目的基因已正确插入pcDNA6.0b表达载体，提取质粒，载体可用于后续实验。

图2 HEK293T细胞基因组电泳鉴定

图3 UCA1 cDNA扩增产物电泳鉴定

图4 pcDNA6-UCA1克隆的PCR鉴定

2.4 HEK293T细胞转染pcDNA6-UCA1后UCA1水平显著升高

为了验证pcDNA6-UCA1在细胞中的表达水平，分别将构建的过表达质粒pcDNA6-UCA1和pcDNA6.0b空载体转染HEK293T细胞，48 h后收取细胞，提取细胞的总RNA，1%琼脂糖电泳检测显示细胞总RNA质量良好（图5）。反转录获得cDNA后进行实时荧光定量PCR检测，相对于对照组（转染pcDNA6.0b），转染过表达质粒pcDNA6-UCA1后，HEK293T细胞内UCA1 RNA水平显著升高（图6）。

2.5 miR-216b加速细胞内源lncRNA-UCA1的降解

在HEK293T和HeLa细胞中转染miR-216b mimic及对照，同时用放线菌素D抑制细胞转录，收取3个时间点（转染后0、4、8 h）的细胞总RNA，1%琼脂糖检测显示RNA完整性良好。反转录获得cDNA后，用实时荧光定量PCR检测转染对照组与miR-216b mimic组HEK293T细胞（图7）和HeLa细胞（图8）各时间点的UCA1水平。结果发现，在2种细胞中，相较于对照组，转染miR-216 mimic组UCA1的半衰期明显减短，UCA1的降解速率显著增加，UCA1与miR-216b竞争结合后，miR-216b能够与UCA1结合影响其稳定性，加速细胞内源lncRNA-UCA1分子的降解。

图5 转染过表达质粒细胞总RNA质量检测

图6 qPCR检测UCA1的表达

2.6 miR-216b加速外源过表达的lncRNA-UCA1的降解

将0.5μg pcDNA6-UCA1分别转染HEK293T和HeLa细胞，24 h后再转染50 pmol miR-216b mimic及对照，并用放线菌素D抑制转录，收取3个时间点的细胞总RNA，电泳检测总RNA质量。反转录得到cDNA，用实时荧光定量PCR检测HEK293T细胞（图9）和HeLa细胞（图10）中UCA1的半衰期。结果显示，与对照组相比，转染miR-216b mimic组的lncRNA-UCA1的半衰期缩短，lncRNA-UCA1的降解明显加快，miR-216b能够加速降解外源表达的UCA1。

2.7 miR-216 inhibitor抑制miR-216b对UCA1的加速降解作用

图7 qRT-PCR检测HEK293T细胞多个时间点UCA1水平

图8 qRT-PCR检测HeLa细胞多个时间点UCA1水平

图9 qRT-PCR检测过表达UCA1并转染miR-216后HEK293T细胞的UCA1水平

在HEK293T和HeLa细胞中分别转染0.5μg pcDNA6-UCA1，24 h后转染100 pmol miR-216b inhibitor及对照，同时用放线菌素D抑制细胞转录，收取3个时间点的细胞总RNA，1%琼脂糖电泳检测RNA质量。反转录获得cDNA，实时荧光定量PCR检测HEK293T细胞（图11）和HeLa细胞（图12）的UCA1半衰期。结果显示，miR-216b inhibitor实验组lncRNA-UCA1的半衰期相比于对照组明显增长。

3 讨论

图10 qRT-PCR检测过表达UCA1并转染miR-216后HeLa细胞的UCA1水平

图11 qRT-PCR检测过表达UCA1并转染miR-216 inhibitor后HEK293T细胞的UCA1水平

图12 qRT-PCR检测过表达UCA1并转染miR-216 inhibitor后HeLa细胞的UCA1水平

越来越多的研究表明，lncRNA和miRNA皆可广泛参与基因的转录后调控，它们能够参与细胞内几乎所有的生物学过程。随着研究的不断深入，miRNA对基因的调控及受其他分子调控的机制也越来越清楚，miRNA结合靶mRNA后能导致靶mRNA的剪切或翻译抑制，miRNA本身的产生与代谢也受多种水平的调控[3]。而lncRNA的功能则较为复杂多变，可作为信号分子、诱饵分子、导向分子及分子支架。miRNA的“分子海绵”的功能就是其作为诱饵分子的一种体现形式，而正是这种功能将lncRNA和miRNA这2种对细胞的各项生物学活动有重要影响的分子紧密联系到了一起。

miRNA靶向mRNA后，根据是否完全互补匹配引起靶mRNA的剪切，进而加速靶mRNA的降解或对靶mRNA翻译进行抑制，而lncRNA与mRNA的结构非常类似，其内也含有miRNA的结合位点，所以lncRNA作为miRNA的“分子海绵”，其在竞争结合miRNA后，理论上也会受miRNA的调控，即lncRNA与miRNA应存在相互调控关系。我们的实验证实，含有miR-216b结合位点的lncRNA-UCA1结合miR-216b后，自身半衰期显著缩短，说明miR-216b加速了UCA1分子的降解，而miR-216b的抑制剂能够延长UCA1分子的半衰期，加强其稳定性。但是，导致UCA1加速降解的确切分子机制还须探讨。本研究为了解lncRNA的“分子海绵”功能提供了新的线索，同时也加深了我们对lncRNA-miRNA-mRNA之间相互调控网络的理解。

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m iR-216b Accelerated Decay of lncRNA-UCA1 in Cultured Cells

ZHENG Wei,GUO Xiao-Hua,DONG Jie,LI Shao-Hua,DING Hong-Mei,LI Hui, HUANG Ai-Xue,XIA Wei,BAI Chen-Jun,LI Da,GENG Jie,LI Jie*,SHAO Ning-Sheng*
Beijing Institute of Basic Medical Science,Beijing 100850,China

Objective:To explore the effects of miR-216b on lncRNA-UCA1 after miR-216b binding with UCA1.Methods:Genome was extracted from HEK293T cell,and from which UCA1-coding sequence was amplified by PCR with specific primers,then the gene fragment was cloned into pcDNA 6.0b vector.Cells were transfected with miR-216b mimic and treated with actinomycin D,then total RNA were extracted at three time points and qRT-PCR was performed to detect the half-life of UCA1.The recombinant pcDNA6-UCA1 was transfected into cells for 24 h,then we transfected miR-216b mimic or miR-216b inhibitor into cells and treated cells with actinomycin D,three time points total cell RNA was harvested,and UCA 1 half-life was detected by qRT-PCR.Results:UCA1 RNA level was remarkably increased after transfection of pcDNA6-UCA1.Overexpression of miR-216b significantly reduced the half-life of both endogenous and exogenous UCA 1 compared to the control group. miR-216b inhibitor could prolong UCA1 half-life and enhance UCA1 RNA stability.Conclusion:miR-216b could accelerate decay of UCA1 which provided a new thought for interaction between miRNA with lncRNA.

UCA1;long non-coding RNA;miR-216b;decay

Q78

A

1009-0002（2017）03-0227-06

10.3969/j.issn.1009-0002.2017.03.001

2017-01-18

国家自然科学基金（31370794，31570817，31200566）

郑伟（1990-），男，硕士研究生，（E-mail）jaycheng0920@foxmail.com

邵宁生，（E-mail）shaonsh@hotmail.com；李洁，（E-mail）jannbio@163.com

*Co-corresponding authors,SHAO Ning-Sheng,E-mail:shaonsh@hotmail.com;LI Jie,E-mail:jannbio@163.com