产丙酮酸棒状杆菌的鉴定及微生物学性状研究

冯佳佳，吴倩倩，王保强，孙铭艳，陶元勇



产丙酮酸棒状杆菌的鉴定及微生物学性状研究

冯佳佳1，吴倩倩1，王保强2，孙铭艳2，陶元勇2

目的 对临床分离于皮脂腺囊肿标本中的菌株进行表型和基因型鉴定，描述该菌株的生物学特性及致病性，为临床诊断提供准确地病原学依据。方法 对分离菌株进行革兰氏染色等，并使用VITEK 2 Compact全自动微生物分析仪进行鉴定。采用K-B法进行药敏试验。提取分离菌株DNA，采用通用引物对16S rRNA基因进行PCR扩增并测序，将测序结果与GenBank中收录的16S rRNA基因序列进行BLAST同源性对比。结果 分离菌株经VITEK 2 Compact鉴定为玫瑰色库克菌，后经16S rRNA序列测定方法鉴定，分离菌株为产丙酮酸棒状杆菌。药敏试验显示该菌株对四环素、万古霉素、利福平敏感，对青霉素、红霉素、克林霉素、环丙沙星、左氧氟沙星、复方新诺明、头孢吡肟、亚胺培南、庆大霉素等均耐药。结论 对于表现型不易鉴定或鉴定不准确的细菌，采用16S rRNA序列测定的方法进行鉴定是最准确的。产丙酮酸棒状杆菌是引起患者疾病的致病菌。在完善产丙酮酸棒状杆菌生化反应信息的同时，探索出有效可行的生物学鉴定方法。

产丙酮酸棒状杆菌；生物学特性；16S rRNA

棒状杆菌属是革兰氏染色阳性杆菌，因其一端或两端呈棒状膨大而得名。棒状杆菌属有103个种和亚种，其中白喉棒状杆菌、假白喉棒状杆菌等40余种与人类致病性有关。产丙酮酸棒状杆菌是棒状杆菌属的新种，由Tong J等在2006年从美国一所医学研究中心采集的一例腹股沟脓肿标本中分离，并根据其表型特点于2010年正式将其命名为产丙酮酸棒状杆菌[1]。仝佳等认为该菌极有可能为非致病菌[2]。但本研究将皮脂腺囊肿患者的脓液标本进行培养，仅分离得到产丙酮酸棒状杆菌单一菌株。本研究旨在通过表型和基因型鉴定更具体的描述该菌的生物学特性，为临床实验诊断提供病原学鉴定提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病历资料 患者，女性，38岁，因“发现胸骨旁皮肤肿物约1周”来我院就诊。患者发病后，出现肿物进行性肿大，可触及波动感，疼痛明显，体温无明显增高，诊断为“皮脂腺囊肿”收治入院。后于我院行“脓肿切开引流术”，引流脓液进行细菌培养+鉴定+药敏试验。临床根据药敏结果选用利福平、多西环素等抗感染治疗9 d，患者感染得到有效控制，病情好转出院。

1.1.2 主要仪器与试剂 2720 thermal cycler PCR仪为美国Applied Biosystems 公司产品；DYCP-31DN DNA电泳槽为北京六一仪器厂产品；FR980凝胶成像仪为上海复日科技仪器有限公司产品；Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒，Sanprep DNA柱式DNA胶回收试剂盒购于上海生工生物工程股份有限公司；Taq酶，dNTPs,SM0337 DNA Ladder Marker为上海生工生物工程股份有限公司；琼脂糖凝胶为加拿大BBI公司产品。Tween80购自国药集团化学试剂有限公司。16SrRNA序列通用引物:

27F:AGTTTGATCMTGGCTCAG

1429R:GGTTACCTTGTTACGACTT

1.2 细菌鉴定及药敏试验方法 将患者引流脓液标本接种于哥伦比亚血琼脂平板，经35 ℃、5% CO2培养箱孵育48 h。取菌落及标本涂片经革兰染色后镜检。使用VITEK 2 Compact全自动微生物分析系统GPI卡上机鉴定，并根据仪器SOP文件进行操作。使用微量生化反应管，补做部分生化反应。药敏试验采用K-B法。

1.3 需脂培养实验 分别接种分离菌株于普通肉汤培养基和加有1% Tween 80的肉汤中，培养于37 ℃，72 h，观察细菌生长情况[3]。

1.4 16S rRNA基因测序分析

1.4.1 细菌基因组DNA的提取 取分离株接种于肉汤培养液孵育过夜，加入1.5 mL离心管中，室温8 000 r/min离心1 min，弃上清，收集菌体。使用Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒说明书进行提取。

1.4.2 PCR扩增基因序列 反应体系(25 μL):基因组DNA 0.5 μL(20～50 ng/μL),10×Buffer(含Mg2+) 2.5 μL，2.5 mmol/L dNTP 1μL， Taq酶0.2 μL,通用引物F(10 μmol/L)0.5 μL，R(10 μmol/L) 0.5 μL，加ddH2O至25 μL，混匀，稍离心，加1滴矿物油。94℃预变性4 min；94 ℃ 45 s，55 ℃ 45 s,72 ℃ 1 min,共30轮循环，72 ℃延伸10 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳(150 V、100 mA、20 min)，EB染色，采用自动凝胶成像系统拍照。

1.4.3 PCR产物回收及测序 采用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒对16S rRNA PCR产物进行纯化回收，由上海生工生物工程股份有限公司进行测序。

1.4.4 序列同源性比对 将16S rRNA基因片段导入美国NCBI网站的BLAST在线软件，进行BLAST序列对比，获取与该16S rRNA基因序列同源的序列和对应的细菌名称。

2 结 果

2.1 细菌培养与鉴定 分离培养48 h后，在血平板上可见圆形，光滑，中央隆起，透明的小菌落(图1)。标本及菌落涂片经革兰染色后可见革兰氏阳性杆菌，棒状(图2)。使用VITEK 2 Compact 鉴定，GPI卡鉴定结果为玫瑰色库克菌，鉴定值为89%，生化反应编码为000064100000000。生化反应如下：脲酶(-)，β-葡糖醛酸糖苷酶(+)，β-半乳糖苷酶(-)α-糖苷酶(-)，β-糖苷酶(-)，N-乙酰-β-葡萄糖苷酶(-)，葡萄糖(-)，核糖(-)，木糖(-)，蔗糖(-)，麦芽糖(-)，甘露醇(-)。后参考《实用临床微生物学检验与图谱》补做：触酶(+)，硝酸盐还原试验(+)，CAMP试验(+)，动力(-)，七叶苷水解试验(-)，O/F 试验为F。亲脂性培养发现，分离菌株可生长于添加有1% Tween 80的肉汤中，在单纯肉汤培养基中培养3 d仍无细菌生长，这说明该分离菌株具有亲脂性。由于玫瑰色库克菌为革兰氏阳性球菌，其镜下特点与分离菌株明显不符，故后续进行16S rRNA检测来鉴定该菌株。

图1 菌株分离培养48 h后Fig.1 Isolated strains after 48 h of incubation

图2 标本及菌落涂片经革兰氏染色后Fig.2 Specimens and colony smear after gram staining

2.2 分离株与06-17730T菌株生化反应比较 见表1。

表1 分离株与06-17730T菌株生化反应比较表
Tab.1 Biochemical reaction of the 06-17730Tstrain of description and the isolated strain

生化反应06-17730T分离菌株CAMP试验(CAMPreaction)-+硝酸盐还原(Reductionofnitrates)-+触酶(Catalase)++产生(Productionof):β-葡糖醛酸糖苷酶(β-Glucuronidase)++脲酶(Urease)--α-糖苷酶(α-Glucosidase)--β-糖苷酶(β-Glucosidase)--N-乙酰-β-葡萄糖苷酶(N-acetyl-β-glucosaminidase)--发酵(Fermentationof):核糖(D-Ribose)+-木糖(D-Xylose)+-葡萄糖(D-Glucose)+-麦芽糖(Maltose)+-蔗糖(Sucrose)+-果糖(Fructose)+未做甘露醇(D-Mannitol)--

+:positive; -:negative

2.3 药敏试验 分离菌株的药敏试验结果显示该菌株对四环素、万古霉素、利福平敏感，对青霉素、红霉素、克林霉素、环丙沙星、左氧氟沙星、复方新诺明、头孢吡肟、亚胺培南、庆大霉素等均耐药。

2.4 分离菌16S rRNA基因序列分析 以提取的分离菌株DNA为模板，进行PCR扩增，产物经1%琼脂糖凝胶电泳，其大小约为1 400 bp(图3)。扩增产物回收后测序，显示16S rRNA基因序列为1 359 bp(图4)。在NCBI上进行BLAST序列对比，登录号为KF372873.1，分离菌株的1 359 bp片段序列与棒状杆菌属的产丙酮酸棒状杆菌新种的16S rRNA基因序列100%一致，因此可以确定该分离菌株为产丙酮酸棒状杆菌。

M: DNA marker; 1: The PCR products of isolated strains.图3 分离菌株16S rRNA基因PCR扩增产物电泳图Fig.3 PCR products electrophoresis of isolated strains 16S rRNA gene sequences

图4 分离菌株16S r RNA基因全序列(1 359 bp)Fig.4 16S rRNA gene sequences of isolated strains(1 359 bp)

3 讨 论

棒状杆菌属是革兰氏染色阳性杆菌，棒状，在自然界中分布广泛，从致病性角度可以将其分为三类：人类致病菌，动植物致病菌，非致病性土壤源菌。目前，对人类致病棒状杆菌以白喉棒状杆菌为代表，其余多被报道为条件致病菌，对棒状杆菌的研究也主要集中在白喉棒状杆菌致病方面[4]及棒状杆菌应用于工业生产方面[5-7]，而对于较为少见的条件致病性棒状杆菌的报道相对较少[8]。因此，在临床分离到相关致病菌株时，可能因为参考的文献较少以及缺乏准确的鉴定手段而造成漏诊。

从皮脂腺囊肿患者的脓液标本中分离得到的菌株，经鉴定为产丙酮酸棒状杆菌。在仝佳等[1]的研究中发现，产丙酮酸棒状杆菌细胞壁内不含有结核硬脂酸，不产生白喉毒素，并且在标本中除分离得到产丙酮酸棒状杆菌外还有其他伴随菌株，且三者浓度相同，故认为产丙酮酸棒状杆菌极有可能为非致病性棒状杆菌。但在本研究获得的脓液标本中仅分离得到产丙酮酸棒状杆菌，无其他相关伴随菌，并且临床根据本次试验的药敏结果用药后，患者感染得到有效控制，病情好转出院。因此认为，产丙酮酸棒状杆菌是引起该患者皮脂腺囊肿的致病菌，其具体致病机制有待于进一步研究。目前，仅有少数与产丙酮酸棒状杆菌相关的研究[9-11]，产丙酮酸棒状杆菌可以引起疾病还没有相关报道。通过本次报道引起临床医生重视，并为临床疾病的诊断提供病原学依据即为本次研究的意义所在。

在本研究中，分离菌株及标本经革兰氏染色后见到革兰氏阳性的棒状杆菌，这与使用VITEK 2 Compact全自动微生物分析仪鉴定的玫瑰色库克菌的结果不相符。为准确鉴定该菌株，后进行16S rRNA序列测定。16S rRNA序列测定属于基因型鉴定，相较于常规的表型鉴定更稳定，受环境影响较小[12-13]，并且16S rRNA序列测定重复性好，可以用于所有的病原细菌。对于表现型不易鉴定或鉴定不准确的细菌，可以采用16S rRNA序列测定的方法进行准确的鉴定[14]。经16S rRNA序列测定，该分离菌株为产丙酮酸棒状杆菌，属于棒状杆菌新种。目前，还没有在国内分离到该菌的相关报道，对其开展的研究也相对较少，缺乏可以准确鉴定该菌的表型鉴定方法，所以采用16S rRNA序列测定方法进行鉴定是最准确的。

为更加全面的描述该分离菌株的生物学性状，探索出有效可行的生物学鉴定方法，在此将该菌株与Tong J等报道的06-17730T菌株的生化反应进行了比较(表1)。发现06-17730T菌株的触酶、β-葡糖醛酸糖苷酶试验为阳性，脲酶、α-糖苷酶、β-糖苷酶、N-乙酰-β-葡萄糖苷酶阴性，与分离菌株结果相同；CAMP试验、硝酸盐还原反应试验为阴性，发酵木糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、核糖，而分离菌株的CAMP试验、硝酸盐还原反应试验为阳性，不发酵木糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、核糖，说明虽然经16S rRNA序列测定鉴定这两种菌株均为产丙酮酸棒状杆菌，其部分生化反应结果并不一致，具有多样性。但二者在触酶、β-葡糖醛酸糖苷酶试验、脲酶、α-糖苷酶、β-糖苷酶、N-乙酰-β-葡萄糖苷酶、半乳糖苷酶试验的结果表现出的一致性说明产丙酮酸棒状杆菌的这部分生化反应相对稳定。此外，分离菌株的需脂性培养试验说明分离菌株具有亲脂性，与06-17730T菌株结果相同。因此在进行生物学性状鉴定时，若根据其菌落特点、革兰氏染色结果判定分离菌株为革兰氏阳性的棒状杆菌，则可进一步根据本研究描述的触酶、β-葡糖醛酸糖苷酶、脲酶、α-糖苷酶、β-糖苷酶、N-乙酰-β-葡萄糖苷酶、半乳糖苷酶试验这些相对稳定的生化反应及需脂性培养试验，考虑标本分离菌株为产丙酮酸棒状杆菌。

综上所述，产丙酮酸棒状杆菌是导致该患者皮脂腺囊肿的主要致病菌。目前针对产丙酮酸棒状杆菌开展的研究较少，本研究通过描述该分离菌株的生化反应，为以后的表型鉴定工作提供更加全面的鉴定依据。此外，临床上采用全自动微生物分析仪对细菌进行鉴定，方便且易于操作，但对于临床表现型不易鉴定或鉴定不准确的细菌缺乏特异性，容易造成漏诊，利用16S rRNA序列测定方法进行鉴定更为可靠。目前，对产丙酮酸棒状杆菌致病机制不是十分明确，有待于进一步的研究，可以通过进一步分析该菌的生化反应特点、生长条件、菌体成分及毒力等方面进行探究，还可以通过构建动物疾病模型，观察分离菌株对动物的致病性，间接探究其与人类疾病的关系，这对于临床疾病的发生与发展，预防、诊断及治疗均具有深远意义。

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Identification and microbiological characteristics ofCorynebacteriumpyruviciproducens

FENG Jia-jia1,WU Qian-qian1,WANG Bao-qiang2,SUN Ming-yan2,TAO Yuan-yong2

(1.InstituteofNanomedicineTechnology,DepartmentofLaboratoryMedicine,WeifangMedicalUniversity/InstitutionalKeyLaboratoryofClinicalLaboratoryDiagnostics,12th5-yearProjectofShandongProvince,WeifangMedicalUniversity/KeyDisciplineofClinicalLaboratoryMedicineofShandongProvince,AffiliatedHospitalofWeifangMedicalUniversity,Weifang261053,China; 2.ClinicalLaboratory,theAffiliatedHospitalofWeifangMedicalUniversity,Weifang261053,China)

The phenotype and genotype of the strains isolated from the sebaceous cysts were identified,and the biological characteristics and pathogenicity of the strains were described,which provided accurate etiological evidence for clinical diagnosis. Isolated strains were Gram stained and identified with VITEK 2 compact automatic microorganism analyzer. Antimiocrobial susceptibility testing was performed by K-B method. DNA was extracted from the isolated strains. The 16S rRNA fragment was amplified by universal primers PCR and sequenced. BLAST was used to compare the homology of the sequences to the 16S rRNA gene sequence in GenBank. Results showed that the isolated strain was identified asKocuriaroseusby VITEK 2 Compact,and then identified by 16S rRNA sequencing method asCorynebacteriiumpyruviciproducens. Drug sensitive testing indicated that the isolates was sensitive to tetracycline,vancomycin,rifampin but resistant to penicillin,erythromycin,clindamycin,ciprofloxacin,levofloxacin,and compound new Ming,cefepime,imine pei south,gentamicin resistance. It is concluded that the phenotype of bacteria is not easy or inaccurate to identify; the 16S rRNA sequence is the most accurate determination method of identification. TheCorynebacteriumpyruviciproducensis a pathogenic bacterium causing the disease of the patient. At the same time,to improve the biochemical reaction information ofCorynebacteriumpyruviciproducens,the effective and feasible method of biological identification is also explored.

Corynebacteriumpyruviciproducens; biological characteristics; 16S rRNA

Tao Yuan-yong,Email: taoyuanyong@163.com

10.3969/j.issn.1002-2694.2017.05.006

陶元勇，Email:taoyuanyong@163.com

1.潍坊医学院医学检验学系纳米医学技术研究所，潍坊 261053; 2.潍坊医学院附属医院检验科,潍坊 261053

R372

A

1002-2694(2017)05-0418-05

2017-01-03 编辑：刘岱伟