miR-16在金黄色葡萄球菌脓毒症中的表达及意义探讨

王家学，陈 燕，刘小香，孙爱华，杨 珺，吕火烊，周永烈



miR-16在金黄色葡萄球菌脓毒症中的表达及意义探讨

王家学1，陈 燕2，刘小香3，孙爱华3，杨 珺1，吕火烊4，周永烈4

目的 探讨miR-16表达水平与金黄色葡萄球菌脓毒症严重程度的关联性，进一步探讨其潜在的临床意义。方法 收集金黄色葡萄球菌脓毒症血液标本共计32例，脓毒性休克、严重脓毒症和一般脓毒症各8例，不同年龄段的健康对照24例；另外，收集革兰氏阴性菌脓毒症血液标本8例。用Trizol液裂解全血后提取microRNA，采用荧光定量PCR测定miR-16在不同组的表达水平(2-△△Ct法)，用SPSS 13.0软件分析各组之间的统计学差异。采用SPSS 13.0软件将miR-16定量值与相应CRP和PCT值进行相关性分析。结果 miR-16表达水平与金黄色葡萄球菌脓毒症严重程度呈明显的负关联，各实验组与对照组相比均有统计学差异(P<0.001)，实验组之间也有统计学差异(P<0.01)。miR-16表达水平与CRP和PCT值呈负相关性，相关系数分别为-0.561和-0.769。结论 miR-16表达与金黄色葡萄球菌脓毒症有明显的负关联性，提示其可能作为该菌脓毒症严重程度的标记物。

miR-16;金黄色葡萄球菌;脓毒症

金黄色葡萄球菌可引起临床严重感染。脓毒症是在细菌感染基础上以促炎症激活过程为特征的全身性反应状态[1]，死亡率高且患病率正逐年递增[2]。目前，脓毒症治疗主要为抗菌和抗炎，但这些方法的临床应用效果有限。微小RNA(microRNA，又称miRNA或miR)可调控炎症通路上的多个靶点，在免疫反应的调节方面发挥重要作用[3]。miRNA是生物体内长度约23个核苷酸左右的非编码小RNA，可与蛋白编码的mRNA互补配对而在转录后水平抑制靶基因表达[4]。它也能通过调控脓毒症信号转导通路中一些关键分子而间接调节促炎因子和抗炎因子的表达平衡[5]。鉴于miRNA对脓毒症炎症反应具有调节作用，深入研究其在金黄色葡萄球菌脓毒症炎症反应中的作用，可对该病的预防和治疗开拓一种潜在思路。

miR-16能防止炎症反应过度扩大[6]，在促进多种炎症介质的降解方面发挥必要性作用[7]。miR-16与金黄色葡萄球菌脓毒症是否有关联，目前尚无报道。本研究根据脓毒症定义及严重程度分类标准，收集了不同严重程度的金黄色葡萄球菌脓毒症临床血标本，通过荧光定量PCR检测患者血液中miR-16表达水平，采用统计学方法探讨了miR-16表达是否与脓毒症严重程度有关联。为了进一步探讨miR-16的临床意义，本文也将其表达水平与CRP和PCT值进行了相关性分析。期望可为进一步探讨miR-16在金黄色葡萄球菌脓毒症发生中的调控机制奠定基础，为该菌脓毒症的预防和治疗找到合理、有效的切入点。

1 材料与方法

1.1 患者与健康对照 根据临床资料选取合适的脓毒症患者，临床病例和健康对照均显示无慢性炎症反应性基础疾病史。本研究纳入了24例金黄色葡萄球菌脓毒症患者、8例革兰氏阴性菌脓毒症患者和24例健康对照者，标本采集均获得了受试者的知情同意。血液标本在诊断为脓毒症后的4 h内采集，抽取患者的抗凝血标本。抽取新鲜血液后，立即将标本转移至无RNA酶试管，用Trizol液裂解血标本，置于-80 ℃冰箱保存待用。

依据《华盛顿国际脓毒症定义会议标准》定义脓毒症，患者符合：存在感染所致的损害性全身炎症反应综合征(SIRS)，有明确或疑似感染灶，以及器官存在损害表现。诊断标准为患者有明确的感染或可疑感染，同时伴有发热(体温>38.3 ℃)或低温(<36.0 ℃)；心率大于90 bpm或大于不同年龄的正常2个标准差；气促大于30 bpm，意识状态发生变化；明显水肿，或液体正平衡大于20 mL/kg超过24 h；高糖血症但未显示糖尿病史。严重程度分级依据《2012年国际严重脓毒症及脓毒性休克诊疗指南》和参考文献[8]。

1.2 主要材料与试剂 从http://www.umm.uni-heidelberg.de/apps/zmf/mirwalk/网站搜索miR-16序列(UAGCAGCACGUAAAUAUUGGCG)，miR-16特异性引物由瑞博生物技术有限公司合成，血标本裂解液(Trizol，#R401-01)和荧光定量PCR试剂(SYBR Green Master Mix，#Q111-02)购自Vazyme生物技术有限公司，microRNA抽提试剂盒(miRcute miRNA isolation kit，#DP501)购自天根生化科技有限公司。采用罗氏电化学发光仪E170测定PCT值，采用BECKMAN特定蛋白仪IMMAGE 800测定CRP值。氯仿、苯酚和乙醇均购自鼎国生物技术有限公司。荧光定量PCR采用LightCycler 480 PCR仪(罗氏)，逆转录采用S1000 Thermal Cycler PCR仪(美国伯乐)。

1.3 实验方法 取新鲜全血1 mL加入等体积Trizol裂解液，置于-80 ℃冰箱保存。小RNA提取时，取出裂解液室温静置5 min。12 000 r/min离心分离上清，加入等体积氯仿后室温12 000 r/min离心，将水相转移至无RNA酶EP管后加入无水乙醇，室温放置2 min。将混合液转移至吸附柱室温放置2 min，12 000 r/min离心。将离心液加入2/3体积无水乙醇，然后将混合液转移至miRlute柱，室温放置2 min，12 000 r/min离心30 s，加入去蛋白液后离心，再加入漂洗液、离心，最后用无RNA酶的去离子水洗脱目标RNA。RNA逆转录的体系为无RNA酶水3.5 μL、4 X g DNA Wiper 2 μL、引物(2 μmol/L)0.5 μL和模板RNA 2 μL，条件为42 ℃ 2 min，然后加入2 μL 5 X HiScript Ⅱ，再50 ℃ 15 min和85 ℃ 2 min。荧光定量体系为BYBR Green 10 μL、引物各0.8 μL、逆转录模板2 μL和去离子水7.2 μL，反应条件为：95 ℃ 5 min，1个循环；95 ℃ 10s，60 ℃ 30s,40个循环；95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，95℃ 15 s，1个循环。CRP和PCT测定均按照生产商的操作说明进行。荧光定量实验每个标本设置3复孔，每个实验重复3次。

1.4 统计学分析 采用2-ΔΔCT法计算miRNA表达水平。用SPSS 13.0软件(IBM，New York，USA)进行统计学分析。荧光定量检测数据采用均数±标准差表示，组间采用ANOVA方差分析，采用非参数Spearman法进行相关性分析。P<0.05为有统计学差异。

2 结 果

本研究纳入了24例金黄色葡萄球菌脓毒症患者，其中脓毒性休克、严重脓毒症和轻度脓毒症各8例，标本主要来源于浙江省人民医院检验中心和感染科。脓毒症患者来源于ICU和老年呼吸病房，健康对照患者来源于门诊体检。本研究收集的金黄色葡萄球菌脓毒症病例全部为60周岁以上患者，男性和女性患者分别为14例和10例。在符合脓毒症定义和分类基础上，所选病例的患者体温、WBC和中性粒细胞比值均明显符合细菌感染的临床指征。

miR-16荧光定量结果以及PCT和CRP测定值如表1所示(均值±SD，n=8/组)。采用2-ΔΔCT法计算miR-16荧光定量值，数值通过健康对照组进行了校正。根据实验结果，一般脓毒症、严重脓毒症和脓毒性休克组的miR-16表达量均值分别为0.2656±0.0727、0.0188±0.0043和0.0046±0.0006。与健康对照组相比，3组分别降低了3.8、53.2和217.4倍。PCT和CRP值也随着脓毒症程度的加重而升高(均值±SD，n=8/组)。

表1 各组受试者miR-16荧光定量值以及CRP和PCT测定值(均值±SD，n=8)
Tab.1 Measured miR-16 values and CRP and PCT values in each group (means±SD,n=8)

健康对照组Healthycontrolgroup(n=8)脓毒症患者组Sepsispatientgroup(n=24)一般脓毒症组Generalsepsisgroup(n=8)严重脓毒症组Severesepsisgroup(n=8)脓毒性休克组Septicshockgroup(n=8)PRNAquantitativevalue10.2656±0.07270.0188±0.00430.0046±0.0006<0.001PCTvalue(ng/mL)0.18±0.050.32±0.050.61±0.134.5±3.1<0.05CRPvalue(mg/L)5.35±2.8442.16±21.8495.63±18.55289.75±154.91<0.001

注：P值计算是依据各脓毒症组v.s.健康对照组。
Note: The p value was calculated based on each sepsis group v.s. healthy control group.

本文的金黄色葡萄球菌脓毒症均为60周岁以上患者，为了排除患者的生理因素对miR-16表达水平的影响，本文选取了24例来自不同年龄段的健康受试者进行了miR-16表达水平的比较，60周岁、18-59周岁和2-18周岁的受试者各8例，miR-16表达水平检测结果如图1所示。结果表明，3个年龄组的健康受试者miR-16的表达水平没有统计学差异(P≥0.05)。

在金黄色葡萄球菌脓毒症中，实验组相对于健康对照组miR-16水平均呈显著性下降，而且随着脓毒症严重度增加，miR-16表达量也逐渐降低。经统计学分析，一般脓毒症组相对于其他组均具有统计学差异(P<0.001)，严重脓毒症组与脓毒性休克组之间也具有统计学差异(P=0.003)。本研究也同时测定了8例革兰氏阴性菌脓毒症患者的miR-16表达水平，结果显示其表达水平显著升高(图2，组1)。

为探究miR-16表达与CRP和PCT之间的关联性，本文也进行了两者的趋势分析。经过非参数Spearman分析，miR-16与CRP和PCT的相关系数分别为-0.561和-0.769，表明miR-16与CRP和PCT值存在负相关性(图3)。

图1 不同年龄段健康受试者的miR-16表达水平Fig.1 Expression of miR-16 in healthy subjects of different ages

1组：革兰氏阴性菌脓毒症患者组；2组、3组和4组分别代表金黄色葡萄球菌一般脓毒症组、严重脓毒症组和脓毒性休克组Group 1: Sepsis group with gram-negative bacterial infection; Group 2,group 3 and group 4 is the general sepsis group,severe sepsis group and septic shock group with Staphylococcus aureus infection,respectively.图2 革兰氏阴性菌和金黄色葡萄球菌脓毒症患者的miR-16表达水平分析Fig.2 Expression of miR-16 in gram negative bacteria and Staphylococcus aureus sepsis

图3 患者miR-16表达水平与CRP和PCT的相关性分析Fig.3 Analysis of the correlation between miR-16 expression and CRP and PCT in patients

3 讨 论

金黄色葡萄球菌脓毒症在革兰氏阳性菌中已跃居首位[9]。细菌脓毒症的研究目前多见于革兰氏阴性菌，金黄色葡萄球菌脓毒症研究较少，探讨该菌脓毒症相关机制具有较大临床价值。miRNA可作为感染性疾病诊断和治疗的潜在靶标[10]，但其产生和致病相关的机制尚不清楚。脓毒症与非感染性全身性炎症反应综合征区别的金标准是血培养，但细菌血培养阳性率较低[11]，因此选取合适血清标志物对于脓毒症辅助诊断较有意义。

本研究发现，在金黄色葡萄球菌脓毒症患者中miR-16表达水平与脓毒症严重程度呈明显负相关，各组之间有统计学差异，与炎症指标PCT和CRP有负相关，提示其可作为金黄色葡萄球菌脓毒症诊断或治疗的潜在靶标，具有较大的潜在临床应用价值。然而，本文发现miR-16在革兰氏阴性菌脓毒症中表达水平显著升高。研究[12]也曾在革兰氏阴性菌中发现miR-16在脓毒症患者中相对于健康对照组表达量明显升高。脓毒症本质上是由病原体感染诱发的炎症反应，但其机制较为复杂[13]，革兰氏阳性和阴性菌主要分别存在脂多糖(LPS)和脂磷壁酸(LTA)，两者在脓毒症发病机制方面会有所不同[14-15]。为了排除患者生理因素可能影响miR-16表达，本文选取了不同年龄组的健康受试者进行了miR-16水平测定，结果显示miR-16表达在不同年龄组的健康受试者中没有统计学差异(P>0.05)，表明患者的生理因素不会对miR-16表达水平造成影响。本文将miR-16表达水平与相应的CRP和PCT测定值进行了相关性分析，发现存在明显的负相关性，表明miR-16可潜在作为金黄色葡萄球菌脓毒症严重程度的分子标记物。

miRNA参与脓毒症诱导性炎症反应信号通路的作用尚不太清楚，但有证据显示Toll样受体(TLR)家族介导了脓毒症炎症发生[16]，该受体是一种可感知保守性病原体相关分子(PAMP)的跨膜蛋白。TLR活化时，其可通过下游激酶激活NF-κB等促炎因子进行炎症反应的调控[16]。TLR家族在不同类别细菌中作用方式不同，TLR2和TLR4分别被革兰氏阳性和阴性菌的成份激活[17]。因此，后续可通过探讨TLR2和NF-κB等信号通路的激活状况，进一步研究miR-16在金黄色葡萄球菌脓毒症中的致病机制。

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Expression level of miR-16 inStaphylococcusaureussepsis and its clinical significance

WANG Jia-xue1,CHEN Yan2,LIU Xiao-xiang3,SUN Ai-hua3, YANG Jun1,LYU Huo-yang4,ZHOU Yong-lie4

(1.DepartmentofLaboratoryMedicine,HangzhouMedicalCollege,Hangzhou310053,China; 2.SpecialWard,ZhejiangTaizhouHospital,Taizhou317000,China; 3.DepartmentofBasicMedicine,HangzhouMedicalCollege,Hangzhou310053,China; 4.TheCenterofClinicalLaboratory,ZhejiangProvincePeople'sHospital,Hangzhou310014,China)

We investigated correlation between the level of miR-16 expression and the severity ofStaphylococcusaureussepsis,and further explored its potentially clinical significance. Blood samples were collected from 32 patients,including each 8 cases of septic shock,severe sepsis and general sepsis,as well as 8 cases of healthy volunteers. Blood samples from 24 cases of healthy subjects with different ages were measured,and additionally 8 cases of blood samples from gram negative bacteria sepsis were also determined in current study as a control. Trizol solution for the whole blood lysis was added into blood samples,and followed by the extraction of microRNA. The expression levels of miR-16 in different groups were measured by fluorescence quantitative PCR,in which 2-Delta Ct method was used. SPSS software (version 13.0) was used to analyze the statistical differences between the groups,and further analyze the correlation between miR-16 value and the corresponding CRP and PCT values. Results showed that the expression level of miR-16 was negatively correlated with the severity ofStaphylococcusaureus

sepsis. There were statistically significant differences in experimental groups when compared with the control (P<0.001),and there was also a statistically significant difference between each experimental group (P<0.01). We found that the expression level of miR-16 was negatively correlated with CRP and PCT,the correlation coefficients were -0.561 and -0.769 respectively,and trend analysis showed that there was a significantly negative correlation. A significantly negative correlation was found between the miR-16 expression level and severity of sepsis,suggesting that miR-16 may serve as a biomarker for the severity ofStaphylococcusaureussepsis.

miR-16;Staphylococcusaureus; sepsis

Sun Ai-hua,Email: sunah123@126.com

10.3969/j.issn.1002-2694.2017.05.008

浙江省自然科学基金(LY16H190006)；国家自然科学青年基金(31501581)；浙江省教育厅一般科研项目(Y201534394)；浙江医学高等专科学校科学研究计划项目(2015XZA02)。

孙爱华，Email: sunah123@126.com

1.杭州医学院检验医学院，杭州 310053； 2.浙江省台州医院特需病区，台州 317000； 3.杭州医学院基础医学部，杭州 310053； 4.浙江省人民医院临床检验中心，杭州 310014

R378.1

A

1002-2694(2017)05-0427-05

2016-08-29 编辑：张智芳

Supported by Natural Science Foundation of Zhejiang Province (No. LY16H190006),the National Natural Science Foundation of China (No. 31501581),the Scientific Research Foundation of Zhejiang Provincial Department of Education (No. Y201534394),and the Scientific Research Plan Project of Hangzhou Medical College (No. 2015XZA02)