益气健脾方对脾气虚证模型大鼠心肌细胞线粒体呼吸链酶复合物活性的影响

李思琦，张哲，杨关林，宋囡，闵冬雨，王凤荣

（辽宁中医药大学1.研究生学院，沈阳110847；2.附属医院中医药实验中心，沈阳110032；3.附属医院心内一科，沈阳110032）

益气健脾方对脾气虚证模型大鼠心肌细胞线粒体呼吸链酶复合物活性的影响

李思琦1，张哲2，杨关林1，宋囡1，闵冬雨2，王凤荣3

（辽宁中医药大学1.研究生学院，沈阳110847；2.附属医院中医药实验中心，沈阳110032；3.附属医院心内一科，沈阳110032）

目的探究益气健脾方对脾气虚证模型大鼠心肌细胞线粒体呼吸链酶复合物活性的影响。方法将30只SD大鼠随机分为正常组、模型组、治疗组，每组10只，对3组大鼠进行分笼饲养。模型组和治疗组大鼠采取饮食干预联合极限游泳法进行脾气虚造模，于实验第15天对3组大鼠的体质量、肛温、食量、饮水量及脾气虚症状积分进行测评。造模成功后，正常组和模型组采用常规饲养方式联合生理盐水灌胃，治疗组采用常规饲养方式联合益气健脾中药汤剂灌胃，时间为8周。之后分别取3组大鼠的心肌线粒体，测定心肌组织线粒体呼吸链酶复合物活性。结果模型组大鼠的线粒体呼吸链酶复合物Ⅱ和复合物Ⅳ活性明显低于正常组（P＜0.05）；治疗组大鼠的线粒体呼吸链酶复合物Ⅱ和复合物Ⅳ活性与模型组比较差异具有统计学意义（P＜0.05）。结论脾气虚能够造成心肌细胞线粒体发生突变和缺失，导致呼吸链酶复合物活性下降，益气健脾中药能够调节心肌组织线粒体呼吸链酶复合物Ⅱ和复合物Ⅳ活性。

益气健脾；脾气虚；线粒体；呼吸链酶复合物

我国传统医学认为，脾为后天之本，气血生化之源，脾主运化，运化血液和水谷精微［1］。脾脏在人体生命活动具有不可代替的位置和作用［2-3］。通过大量研究［4-5］发现，脾脏的生理功能对于解释现代医学的某些特征同样适用，当脾气虚衰时，人体的气化无源，肌肉血脉濡养失司，人体会有虚衰的表现，机体各脏器生理功能、新陈代谢速率、免疫及循环系统均受到影响。若脾气虚衰则机体脏器生命活动异常，甚至进入衰老阶段［6-7］。

线粒体是细胞合成及储藏能量的场所，是体内能量交换及各物质间进行氧化的地点［8］。线粒体呼吸链酶复合物Ⅰ是机体内部能量物质转化合成三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）的桥梁，线粒体呼吸链酶复合物Ⅳ稳定性较差，受到活性氧自由基攻击后，细胞色素氧化酶结合电子的能力下降，导致ATP合成减少，而损伤呼吸产能过程［9-10］。本研究采用脾气虚证大鼠造模，探讨益气健脾方对脾气虚证模型大鼠心肌细胞线粒体呼吸链酶复合物活性的影响。

1 材料与方法

1.1 动物的选择与分组

实验选择SD大鼠30只，雄性，体质量（210.34± 14.38）g，随机分为正常组、模型组、治疗组，每组10只，由辽宁本溪长生生物有限公司提供。模型组和治疗组大鼠采取饮食干预联合极限游泳法进行脾虚证造模，3组大鼠进行分笼饲养，除造模干预外，3组大鼠的饲养方式相同，对大鼠进行颗粒饲料喂药并供其自由饮水，定时对实验室进行温度、湿度、光线等控制，实验过程中严格遵守动物实验的3R原则［10］。

1.2 方法

1.2.1 造模方法：1～14 d，模型组单日对大鼠进行1次甘蓝喂养（18 g/只），自由饮水，进食后对大鼠采用极限游泳法，即将大鼠置于水中，使其自由游泳，直至大鼠首次出现口鼻进入水面之下；双日对大鼠采用猪油脂灌胃（3.0 mL），自由饮水［11］。第15天对模型组大鼠进行脾虚证造模评估，以《实用中医基础学》［12］、全国老年病学会制定的“中医脾虚证参考标准”［13］、大鼠生物学特征以及《实用中医证候动物模型学》［14］为参考标准：（1）体质量明显下降；（2）粪便溏泄、排便次数增多、肛温变化不显著；（3）食欲不振、进食量明显降低；（4）倦怠无力、毛皮失去光泽、蜷缩弓背；（5）睡眠时间增多、游泳时间显著缩短。

1.2.2 治疗方法：造模成功后，正常组和模型组采用常规饲养方式联合生理盐水灌胃，治疗组采用常规饲养方式联合益气健脾中药方［由黄芪10 g、党参10 g、茯苓10 g、白术10 g、炙甘草3 g、丹参10 g、清半夏6 g、瓜蒌10 g组成，以上中药购自辽宁中医药大学附属医院草药局，经生药学鉴定均为合格药材，均按常规煎法并浓缩成含生药（3 g/mL）的浓缩药液备用］灌胃，灌胃剂量为6 g/kg，2次/d，治疗时间为8周。

1.2.3 仪器及试剂：精密数字电子天平、低速离心机、恒温水浴箱、高速离心机（德国公司生产）、DY89-I型电动玻璃匀浆机（宁波仪器研究所）、蛋白核酸分析仪（美国）、电泳、电泳槽。LA TaqDNA（聚合酶宝生物工程有限公司）、EB蔗糖、细胞色素C、甘露糖、肝素、琼脂糖等。

1.2.4 指标测评：实验第15天对各组大鼠进行取材及指标测评。

1.2.4.1 脾气虚症状评分满分为10分。粪便溏泄，2分；毛质无光，2分；倦怠无力，2分；蜷缩弓背，2分；食量减少，1分；形体消瘦，1分。得分越高说明脾气虚证越典型［13］。

1.2.4.2 呼吸链酶复合物活性测定将大鼠心肌组织放入液体氮中，并置于-70℃冰箱中冷冻储存备用。（1）心肌组织线粒体溶液的制备，从冰箱中取出0.6 g心肌组织，在0℃以下的冷冻中将其切碎，加入分离介质6 mL，0℃以下离心，4 000 r/min持续4 min，取上部清液，0℃离心，10 000 r/min持续15 min。取下层沉淀物用洗液洗涤干净后，离心并置于0.5 mL的分离介质中保存备用。（2）呼吸链酶复合物的测定，取干净烧杯，加入浓度为0.20 mol/L的磷酸缓冲液2.0 mL、浓度为1.25 mol/L的还原性细胞色素C 0.05 mL。倒入蒸馏水使烧杯内溶液体积达到3.0 mL，用经过波长为0.55 mm的连续波照射的心肌线粒体溶液进行动力学测定后，加入固定维生素C及高铁氰化钾，最后测出细胞色素C完全和不完全氧化的光吸收，算出细胞色素C的数值。另取一个干净烧杯，加入分离介质代替心肌线粒体溶液，不加入LTris调配液，其余溶液与第一个烧杯中的溶液相同。计算出每mg心肌线粒体蛋白每分钟消耗还原性细胞色素体积。

1.3 统计学分析

选用SPSS 17.0统计软件进行统计学分析，计量数据以表示。组间比较应用方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.13 组大鼠体质量、肛温（肛周温度）、食量、饮水量及脾气虚症状积分比较

结果显示：与正常组比较，模型组大鼠体质量、食量减少，脾气虚症状积分评分升高（P＜0.05）；与模型组比较，治疗组大鼠体质量、食量升高，脾气虚症状积分评分显著降低（P＜0.05）。见表1。

2.23 组大鼠心肌线粒体呼吸链酶复合物Ⅱ及Ⅳ活性比较

表1 3组大鼠体质量、肛温、食量、饮水量及脾气虚症状积分的比较Tab.1 Comparison of body weight，rectal temperature，food intake，water intake，and spleen qi deficiency syndrome in three groups of rats

表1 3组大鼠体质量、肛温、食量、饮水量及脾气虚症状积分的比较Tab.1 Comparison of body weight，rectal temperature，food intake，water intake，and spleen qi deficiency syndrome in three groups of rats

1）P＜0.05 vs normal group；2）P＜0.05 vs model group.

GroupnBody weight（g）Perianal temperature（℃）Food intake（g/d）Water intake（mL/d）Symptom points Normal10240.02±12.0336.42±1.0210.02±2.1823.03±6.021.11±0.22 Model10150.68±12.411）35.74±1.037.82±2.011）21.44±6.448.83±1.111）Treatment10238.55±13.372）36.05±1.129.51±2.022）22.42±6.111.45±0.632）

表2 3组大鼠心肌线粒体呼吸链酶复合物Ⅱ及Ⅳ活性的比较（s）Tab.2 Comparison of the activity of mitochondrial respiratory chain enzyme complexesⅡandⅣin three groups of rats

表2 3组大鼠心肌线粒体呼吸链酶复合物Ⅱ及Ⅳ活性的比较（s）Tab.2 Comparison of the activity of mitochondrial respiratory chain enzyme complexesⅡandⅣin three groups of rats

1）P＜0.05 vs normal group；2）P＜0.05 vs model group.

GroupnComplexⅡComplexⅣNormal104.89±1.0124.56±7.72 Model101.87±0.591）14.42±4.281）Treatment104.68±0.862）22.97±7.562）

结果显示：与正常组比较，模型组心肌线粒体呼吸链复合物Ⅱ和Ⅳ表达下降，差异具有统计学意义（P＜0.05）；治疗后，与模型组比较，治疗组心肌线粒体呼吸链复合物Ⅱ和Ⅳ表达上升，差异具有统计学意义（P＜0.05），见表2。

3 讨论

当脾气虚衰时，线粒体功能会发生异常。大量动物实验研究［16］发现，脾气虚大鼠心肌、肝和小肠等细胞线粒体含量明显减少，线粒体结构异常。线粒体内膜中存在特殊的由蛋白质组成的能量传递链，包括呼吸链酶复合物Ⅱ、Ⅳ等，这些复合物按照其氧化还原电位顺序排列于线粒体内膜，构成两条呼吸链。氧化反应是人体活性氧的重要来源，当能量传递链功能损伤时，会源源不断的生成羟自由基等，而线粒体自身清除自由基能力下降，则会导致线粒体出现氧化性损伤。复合物Ⅳ是性质最不稳定的、易受损伤的酶，当遭到自由基的破坏时，会导致整个呼吸链结构损伤，进而造成复合物Ⅱ、Ⅳ功能损害，导致整条呼吸链的瓦解，使得呼吸功能发生不可逆的损伤［17］。

线粒体是储藏人体能量的场所，提供生物体内的生物合成、呼吸、分泌及机械运动等全部细胞活动所需要的化学能［18］，在功能上与脾的“后天之本”极为相似。当脾气虚时，细胞内部线粒体功能也同样发生变化，有学者［19］在对脾气虚大鼠线粒体进行观察时发现，脾气虚大鼠线粒体数目较正常大鼠明显减少，且线粒体结构亦发生了内膜损伤、DNA突变、基质外渗等改变。

本研究对大鼠脾气虚证采用饮食干预+极度疲劳法进行造模，成模效果较好，造模大鼠出现脾虚表现，实验结果显示，模型组大鼠的线粒体呼吸链酶复合物Ⅱ和复合物Ⅳ活性与治疗组比较，差异具有统计学意义（P＜0.05），说明大鼠在脾气虚状态下呼吸链酶复合物活性下降，线粒体功能出现异常，同时说明了益气健脾中药能够逆转脾虚大鼠的线粒体功能损伤。线粒体呼吸链酶复合物Ⅱ、Ⅳ活性治疗组略低于正常组，但差异不具有统计学意义（P＞0.05），说明益气健脾中药能够改善大鼠心肌功能，调节线粒体呼吸链酶复合物Ⅱ、Ⅳ升高。

综上所述，脾气虚可导致大鼠心肌组织线粒体呼吸链酶复合物活性下降，而益气健脾中药能够有效缓解、逆转，因此临床中可使用益气健脾中药预防和治疗脾气虚证，改善患者的线粒体功能。机体脾虚则湿邪易困，本研究对湿邪困脾的因素研究甚少，还有待进一步深入探讨。后续将探索“脾喜燥恶湿”与“线粒体内膜外表面pH变化”可能存在的关联机制，为更深入探讨脾虚与线粒体相关的生物学机制及从脾立论防治相关系列疾病提供有力实验证据。

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（编辑 武玉欣）

Effect of a Decoction to Nourish Qi and Invigorate the Spleen on the Activity of Mitochondrial Respiratory Chain Enzyme Complexes in Cardiomyocytes of Rats with Spleen Qi Deficiency Syndrome

LI Siqi1，ZHANG Zhe2，YANG Guanlin1，SONG Nan1，MIN Dongyu2，WANG Fengrong3

（1.Graduate School of Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Shenyang 110847，China；2.The Center of Traditional Chinese Medicine，Affiliated Hospital of Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Shenyang 110032，China；3.Department of Cardiology，Affiliated Hospital of Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Shenyang 110032，China）

Objective To investigate the effect of a decoction to nourish qi and invigorate the spleen on mitochondrial respiratory chain enzyme complex activity in cardiomyocytes of rats with spleen qi deficiency syndrome.MethodsRats were randomly divided into normal，model，and treatment groups.The model and treatment groups were treated by diet intervention combined with the limit swim method.The general condition and spleen qi deficiency syndrome were assessed on day 15.After the success of the model，the normal and model groups were treated with a conventional feeding method combined with normal saline，and the treatment group was treated by diet intervention combined with a decoction to nourish qi and invigorate the spleen for 9 weeks.The activity of two mitochondrial respiratory chain enzyme complexes was observed.ResultsThe activity of mitochondrial respiratory chain enzyme complexⅡand complexⅣin the model group was significantly lower than the activity in the normal and treatment groups（P＜0.05）.The activity levels of complexⅡand complexⅣwere significantly different between the model group and the treatment group（P＜0.05）.ConclusionSpleen qi deficiency can cause decreased activity of mitochondrial respiratory chain enzyme complexes in myocardial cells.The decoction to nourish qi and invigorate the spleen can modulate the activity of myocardial mitochondrial respiratory chain enzyme complexesⅡandⅣ.

nourishing qi to invigorate spleen；spleen qi deficiency；mitochondria；respiratory chain enzyme complex

R541

A

0258-4646（2017）06-0515-04

10.12007/j.issn.0258-4646.2017.06.008

辽宁省教育厅科学技术研究一般项目（L2014365）作者简介：李思琦（1983-），女，主治医师，硕士研究生.

王凤荣，E-mail：wfr925@126.com

2017-01-08

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