载脂蛋白AI对单核细胞表型与MCP-1/CCR2的影响

尹建国，张社兵，彭道泉

（1.汕头大学医学院附属粤北人民医院心血管内科，广东韶关512026；2.中南大学湘雅二医院心血管内科，长沙410011）

载脂蛋白AI对单核细胞表型与MCP-1/CCR2的影响

尹建国1，2，张社兵1，彭道泉2

（1.汕头大学医学院附属粤北人民医院心血管内科，广东韶关512026；2.中南大学湘雅二医院心血管内科，长沙410011）

目的探讨载脂蛋白AI（apoAI）对动脉粥样硬化小鼠血液、脾脏中Ly6Chi单核细胞和单核细胞趋化蛋白1（MCP-1）浓度及CC类趋化因子受体2（CCR2）表达的影响。方法16只雄性apoE-/-小鼠高脂饲料饲养12周后随机分为对照组和apoAI组，处死前第1、3天分别予以生理盐水和apoAI（40 mg/kg）干预，处死12 h前予以腹腔注射脂多糖（LPS）25 μg/只，酶联免疫法检测血浆MCP-1浓度，流式细胞仪检测血液、脾脏中Ly6Chi单核细胞比例。THP-1细胞随机分为对照组和apoAI组，予以相应干预后加入浓度为10 μg/L的LPS孵育，Western blotting检测2组中CCR2的表达。结果与对照组比较，apoAI能显著降低血液及脾脏中Ly6Chi单核细胞比例及血浆中MCP-1浓度（P＜0.01），体外研究显示apoAI能下调单核细胞CCR2的表达（P＜0.05）。结论apoAI能降低MCP-1浓度及血液、脾脏中Ly6Chi单核细胞比例，抑制CCR2的表达。

载脂蛋白AI；单核细胞表型；单核细胞趋化蛋白1；CC类趋化因子受体2

动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）的本质是慢性炎症性疾病，血脂代谢异常、单核细胞参与了AS发生、发展的全过程。研究［1-3］表明，单核细胞是一群异质性细胞，可分为促炎型和静息型2种主要亚型，在小鼠体内对应CD11b+Ly6ChighCCR2+CX3CR1low（Ly6Chi）单核细胞和CD11b+Ly6ClowCCR2-CX3CR1high（Ly6Clow）单核细胞，2种亚型单核细胞在AS中起不同作用；Ly6Chi高表达CCR2，主要与其配体MCP-1结合，受单核细胞趋化蛋白1（monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1）的调控趋化，易迁移至内皮下形成泡沫细胞，有促炎、促AS的作用。Ly6Clow能吞噬坏死组织、促进组织修复，起到抗炎、抗AS的作用。载脂蛋白AI（apolipoprotein AI，apoAI）有抗炎作用，但是apoAI对于单核细胞表型及MCP-1/CC类趋化因子受体2（C-C chemokine repter-2，CCR2）的影响研究较少，本研究旨在探讨apoAI对单核细胞表型及MCP-1/CCR2的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

apoE-/-小鼠购自北京维通利华公司，高脂饲料购自广东省动物实验中心，RPMI1640培养基购自Gibco公司，脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）购自上海联硕生物科技公司，淋巴细胞分离液购自天津灏洋生物制品公司；CCR2、β-actin兔抗人一抗购自Abcam公司，辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗购自武汉博士德公司；CD11b-PE单抗、Ly6c-FITC单抗及同型对照单抗购自Biolgend公司；MCP-1 ELISA试剂盒购自上海信帆生物公司；apoAI用质粒在体外表达纯化取得，纯度＞99%，由湖南远泰生物技术公司协助完成。THP-1细胞购自中科院细胞生物所，为汕头大学医学院附属粤化人民医院心血管内科传代保留，其余试剂均为中南大学湘雅二医院心血管内科实验室提供。

1.2 apoE-/-小鼠的分组与干预

16只apoE-/-小鼠高脂饲料饲养12周后随机分为2组，每组8只。对照组小鼠处死前第1、3天尾静脉注射生理盐水；apoAI组处死前第1、3天尾静脉注射apoAI（40 mg/kg）；所有组小鼠处死12 h前予以腹腔注射LPS 25 μg。所有小鼠实验结束当天处死，结束前12 h禁食禁饮。

1.3 分离血浆及脾脏中单个核细胞

小鼠摘除眼球取血，置入抗凝管中，离心分离血浆和血细胞，血浆置于-80℃冰箱中保存备用；血细胞中加入2 mL RPMI1640液混匀，离心管中预先加入淋巴细胞分离液约5 mL，再将稀释混匀的血细胞液体缓慢加于分离液面上离心后收集第2层白色云雾层，单个核细胞都在此层，洗涤离心后得到单个核细胞，加入含10%FBS的RPMI1640培养基重悬细胞备用。脾脏分离后将脾脏置于100目无菌筛网上轻柔研磨，用RPMI1640液冲洗，收集脾细胞分离液，离心后加红细胞裂解液混悬裂解红细胞，离心，洗涤离心后所得为单个核细胞，加入含有10%FBS的RPMI1640液重悬细胞备用。

1.4 细胞培养与干预

THP-1细胞复苏后用含10%胎牛血清，100 kU/L青霉素和链霉素的RPMI1640培养基置于含5% CO2、37℃且湿度100%的无菌培养箱中培养，细胞状态良好后计数随机分为对照组（予以无血清培养基继续培养3 h）和apoAI组（无血清培养基加入10 mg/L apoAI孵育3 h），每组1.5×106个细胞，2组均加入浓度为10 μg/L的LPS，孵育6 h。

1.5 流式细胞仪检测

按流式细胞抗体说明书进行操作，每管结合细胞数量加入适量抗体，然后上机检测Ly6Chi单核细胞的比例。

1.6 Western blotting检测CCR2表达

分组干预的细胞裂解高速离心后取上清液，BCA法测蛋白浓度，取50 μg上样，经SDS-PAGE电泳后蛋白转移至PVDF膜上，用含5%脱脂牛奶的TBST溶液浸泡封闭2 h，加入1∶1 000的CCR2一抗，4℃孵育过夜，次日PBST液漂洗3次，相应稀释后二抗室温孵育2 h，再PBST液漂洗3次，ECL化学发光显影，在柯达化学发光成像仪中自动显影。用图像分析软件进行灰度值分析，所测得的各目的蛋白的灰度值与相应内参蛋白条带灰度值的比值即为该蛋白的相对表达量。

1.7 酶联免疫法检测血浆中MCP-1浓度

血浆解冻后用ELISA试剂盒检测MCP-1浓度，按照ELISA试剂说明书进行操作，根据各样本在酶标仪450 nm处的OD值以及标准曲线，得到样品浓度。

1.8 统计学分析

应用SPSS 13.0统计软件包进行数据分析，数据均进行正态性分析，凡不符合正态分布的变量均先经对数转换后，再做进一步统计分析。2组均数间比较采用独立样本t检验。数据用x±s表示，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 apoAI对LPS刺激血液中Ly6Chi单核细胞比例的影响

apoAI组与对照组比较，流式细胞仪检测apoAI能明显降低血液中Ly6Chi单核细胞的百分比，差异有统计学意义（P＜0.01），见图1。

2.2 apoAI对LPS刺激脾脏中Ly6Chi单核细胞比例的影响

apoAI组与对照组比较，流式细胞仪检测显示apoAI能明显降低脾脏中Ly6Chi单核细胞的百分比，差异有统计学意义（P＜0.01），见图2。

2.3 apoAI对LPS刺激THP-1细胞CCR2表达的影响

图1 流式细胞仪检测apoAI对LPS刺激血液中Ly6Chi细胞比例的影响Fig.1 Proportion of Ly6Chimonocytes stimulated by LPS in the blood as detected by flow cytometry

图2 流式细胞仪检测apoAI对LPS刺激脾脏中Ly6Chi细胞比例的影响Fig.2 Proportion of Ly6Chimonocytes stimulated by LPS in the spleen as detected by flow cytometry

图3 Western blotting检测CCR2蛋白表达Fig.3 CCR2 expression levels as measured by Western blotting

与对照组比较，apoAI能抑制LPS诱导的CCR2表达，差异有统计学意义（P＜0.05），见图3。

2.4 apoAI对LPS刺激血浆中MCP-1浓度的影响

与对照组比较，apoAI能明显抑制LPS刺激的血浆中MCP-1浓度，差异有统计学意义（P＜0.01），见图4。

3 讨论

图4 apoAI干预对LPS刺激apoE-/-小鼠血浆MCP-1浓度的影响Fig.4 apoAI treatment reduces MCP-1 plasma levels in apoE-/-mice induced by LPS

单核细胞在AS的发生、发展中起重要作用，单核细胞可分为Ly6Chi和Ly6Clow2种主要亚型，Ly6Chi上有CCR2表达，可在MCP-1的刺激下向内皮下趋化、迁移，较Ly6Clow更易浸润迁移至斑块内，转化成M1型巨噬细胞，吞噬脂质形成泡沫细胞，促进AS的发生和发展［4-5］。MCP-1是趋化细胞因子家族中的一员，主要由单核巨噬细胞、成纤维细胞、内皮细胞、平滑肌细胞在受到刺激时分泌，其受体是CCR2，MCP-1/CCR2结合后激活细胞内信号通路发挥作用，能趋化更多的单核细胞向内皮下浸润。有研究［6］证实CCR2-/-apoE-/-小鼠与apoE-/-小鼠比较，血液中促炎型单核细胞数量明显减少，减轻了AS的程度。MAJMUDAR等［7］的研究表明针对单核细胞CCR2的siRNA干预能减少血液中Ly6Chi单核细胞数量，促进心肌梗死的愈合。

apoAI是HDL的主要蛋白成分，在体内主要作为三磷酸腺苷结合盒转运体A1的受体，介导泡沫细胞中游离胆固醇及磷脂的流出，apoAI除了通过促胆固醇逆转运起抗动脉粥样硬化的作用外，apoAI还有抗炎作用，有研究［8］表明在慢性肾病患者，血液中apoAI浓度降低与促炎型单核细胞计数呈反比，能预测患者心血管事件的风险。本研究发现，apoAI在体外能抑制单核细胞CCR2表达，在体内能降低MCP-1的血浆浓度。抑制骨髓中Ly6Chi单核细胞向血液中释放及在脾脏中聚集。

已有研究［9］证实，脾脏不仅是免疫器官，还是髓外“单核细胞库”，在高脂血症及其他病理情况下，脾脏还能髓外造血，释放Ly6Chi单核细胞入血浸润至斑块中，促进AS的发展。心肌梗塞后能激活交感神经系统，直接激活CCR2+祖细胞干细胞，同时使脾脏中大量Ly6Chi细胞源源不断的释放入血趋化于斑块，激活放大炎症，导致冠状动脉事件的反复发生，出现“心肌梗死加剧AS”现象［10-11］。本研究发现，apoAI不但能降低血液中Ly6Chi细胞的比例，还能降低脾脏中Ly6Chi细胞的比例，起抗炎、抗AS的作用。

总之，本研究发现，apoAI在体内能降低血浆中MCP-1浓度，降低血液及脾脏中Ly6Chi细胞比例的作用，在体外能抑制单核细胞CCR2的表达，说明apoAI能调控CCR2的表达，从而调控单核细胞向Ly6Clow细胞分化，提示apoAI降低了血液及脾脏中Ly6Chi细胞比例是通过抑制CCR2、MCP-1的表达而实现的，这为深入理解apoAI的抗炎机制提供实验依据。

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（编辑 于溪）

Effect of Apolipoprotein AI on MCP-1 Plasma Levels，Monocyte Subset Proportions，and in Vitro CCR2 Expression

YIN Jianguo1，2，ZHANG Shebing1，PENG Daoquan2

（1.Department of Cardiology，Yuebei People’s Hospital Affiliated to Shantou University Medical College，Shaoguan 512026，China；2.Department of Cardiology，The Second Xiangya Hospital of Central South University，Changsha 410011，China）

Objective To explore effects of apoAI on MCP-1 levels in the plasma and the Ly6Chimonocyte proportion in the blood and spleen of atherosclerotic mice，as well as on CCR2 expression in vitro.MethodsSixteen male apoE-/-mice were fed with high cholesterol diet for 12 weeks. Mice were randomly divided into control and apoAI groups and were administered with PBS or apoAI（40 mg/kg），respectively，via tail vein on the 1st and 3rd day before sacrifice.Mice in both groups were administered LPS（25 μg/mouse）via intraperitoneal injection 12 h before sacrifice.Plasma levels of MCP-1 were determined using ELISA，and the Ly6Chimonocyte proportion was analyzed using flow cytometry.In addition，human monocytic THP-1 cells were randomly divided into control and apoAI（10 mg/L）-treated groups，pretreated with corresponding intervention，and incubated with LPS（10 μg/L）.CCR2 expression levels were measured by Western blotting.ResultsCompared with the control treatment，apoAI treatment remarkably reduced MCP-1 levels in plasma and Ly6Chimonocyte proportion in the blood and spleen（P＜0.01）.Furthermore，apoAI treatment inhibited CCR2 expression in monocytes in vitro（P＜0.05）.ConclusionapoAI can reduce MCP-1 levels in plasma and the Ly6Chimonocyte proportion in the blood and spleen and can inhibit CCR2 expression in monocytes in vitro.

apolipoprotein AI；monocyte subset；monocyte chemotactic protein 1；CC-chemokine receptor 2

R543.3

A

0258-4646（2017）06-0501-04

10.12007/j.issn.0258-4646.2017.06.005

国家自然科学基金（81370393）

尹建国（1978-），男，副主任医师，博士.

彭道泉，E-mail：pengdq@hotmail.com

2016-10-12

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