Pin1与CyclinD1在胃肠间质瘤中的表达及临床意义

黄子成，陈清，翁晓源，杨振荣，陈惠忠，周永建

（1.福建医科大学附属泉州市第一医院消化内科，福建泉州362200；2.福建医科大学附属协和医院胃外科，福州350001；3.惠安县医院普通外科，福建惠安362100）

Pin1与CyclinD1在胃肠间质瘤中的表达及临床意义

黄子成1，陈清2，翁晓源2，杨振荣2，陈惠忠3，周永建2

（1.福建医科大学附属泉州市第一医院消化内科，福建泉州362200；2.福建医科大学附属协和医院胃外科，福州350001；3.惠安县医院普通外科，福建惠安362100）

目的检测Pin1与CyclinD1蛋白和mRNA在胃肠间质瘤（GIST）中的表达情况，探讨二者与GIST临床病理特征的相关性。方法分别采用免疫组化法和实时荧光定量PCR法检测Pin1与CyclinD1蛋白和mRNA在GIST中的表达情况。结果Pin1和CyclinD1蛋白在GIST中的表达率［64.7%（55/85），42.3%（36/85）］高于癌旁组织［26.7%（4/15），6.7%（1/15）］；Pin1和CyclinD1mRNA在GIST组织中的表达量为癌旁组织中的7.03倍和5.53倍。Pin1蛋白及mRNA的表达与患者的临床病理参数无明显相关性，与GIST的NIH分级和肿瘤直径大小有关（均P＜0.05）。GIST组织中Pin1与CyclinD1蛋白和mRNA的表达呈正相关。结论Pin1与CyclinD1蛋白和mRNA在GIST中表达增加，且二者的表达呈正相关，提示二者在GIST的发生发展中起协同作用。

胃肠间质瘤；Pin1；CyclinD1；免疫组化；实时荧光定量PCR

胃肠间质瘤（gastrointestinal stromal tumor，GIST）是胃肠道中最为常见的间叶源性肿瘤，其发病机制与突变有关。肽基脯氨酰顺反异构酶1（peptidylprolyl cis/trans isomerase，NIMA-interacting 1，Pin1）是一种特异的肽基脯氨酰异构酶。细胞周期蛋白D1（CyclinD1）基因是一种原癌基因，可调节细胞周期进行有丝分裂和增殖。CyclinD1是Pin1重要的靶基因之一。二者在GIST中的表达情况及临床意义尚未明确。本研究通过免疫组化法和实时荧光定量PCR技术分别从蛋白和mRNA水平研究GIST中Pin1和CyclinD1蛋白及mRNA表达情况及临床意义。

1 材料与方法

1.1 研究对象

收集2007年至2014年在福建医科大学附属协和医院行手术切除的GIST的肿瘤组织及癌旁组织石蜡包埋标本85例。研究对象均符合GIST的诊断标准，且经病理证实为原发性GIST；患者术前均未行放疗或化疗等辅助治疗；且均无合并其他恶性肿瘤。冰冻组织标本均为手术中取得，放置于-80℃液氮中保存。

1.2 方法

1.2.1 免疫组化：采用ElivisionTMplus免疫组织化学法。Pin1抗体（sc-15340）购自美国Santa Cruz公司，工作浓度为1∶200；即用型CyclinD1抗体购自北京中杉金桥试剂公司；ElivisionTMplus二抗（KIT-9901）购自福州迈新生物技术公司。结果判断采用Fromowitz的阳性细胞半定量分级法，每个切片随机观察5个高倍视野（×400），先根据阳性细胞数占肿瘤细胞总数的百分比计分，≤5%为0分，＞5%～25%为1分，＞25%～50%为2分，＞50%～75%为3分，＞75%为4分；再根据阳性细胞染色强度的深浅计分，不着色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分，最后将二者分数相加，≤3分为阴性，＞3分为阳性。

1.2.2 实时荧光定量PCR（qRT-PCR）：采用SYBR GreenⅠ荧光染料法及相对定量的检测方法，以βactin作为参照基因。UltraSYBR Mixture（With high ROX）购自福州贝尔曼公司；RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit购自Thermo公司；RNAiso plus购自日本TaKaRa公司。qRT-PCR的Pin1及CyclinD1引物序列设计参照GenBank中捡索到的Pin1基因序列（NM_006221.2）和CyclinD1基因序列（NM_ 053056.2），用Primer3.0设计引物，引物序列见表1；引物由金斯瑞生物科技有限公司合成。qRT-PCR的结果判断采用2-△△CT（Livak）法行相对基因表达分析。目的基因和参照基因的扩增效率均接近1.95，计算公式为1.95-△△CT。

表1 实时荧光定量PCR引物序列Tab.1 Primer pairs used for qRT-PCR analysis

1.3 统计学分析

采用SPSS 12.0软件进行统计分析，计数资料用χ2检验或Fisher确切概率法进行检验，用Spearman等级相关分析Pin1及CyclinD1表达的相关性。计量资料用x±s表示，采用配对样本t检验或两独立样本t检验进行比较，采用双变量相关性分析Pin1与CyclinD1表达的相关性。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 免疫组化结果

Pin1蛋白和CyclinD1在GIST组织及癌旁组织中的表达定位于细胞质及细胞核中。Pin1和CyclinD1蛋白在GIST中的表达率［64.7%（55/85），42.3%（36/85）］明显高于癌旁组织［26.7%（4/15），6.7%（1/15）］（P＜0.05）。

Pin1蛋白的表达与患者的性别、年龄、核分裂象、NIH分级、肿瘤直径大小、肿瘤位置、组织学类型、远处转移均无明显相关性（P＞0.05）（表2）。CyclinD1蛋白表达与NIH分级和肿瘤直径大小有关（P＜0.05），与患者的性别、年龄、核分裂象、肿瘤位置、组织学类型及远处转移无明显相关性（P＞0.05）（表3）。

85例GIST组织中Pin1与CyclinD1蛋白均阳性表达者29例，均阴性表达者23例。Spearman等级相关分析结果表明GIST中Pin1蛋白与CyclinD1蛋白的表达呈正相关（r=0.284，P＜0.01）。

2.2 qRT-PCR结果分析

表2 Pin1蛋白表达与GIST临床病理参数的关系Tab.2 Relationship between Pin1 protein expression and clinicopathological parameters of GIST

GIST组织和癌旁组织中，Pin1的△CT值分别为6.02±1.13和8.94±1.56，CyclinD1分别为5.62±6.93和8.18±2.00，差异均有统计学意义（P＜0.05）。2-△△CT（Livak）法公式计算结果显示，Pin1和CyclinD1 mRNA在GIST组织中的表达量为癌旁组织中的7.03倍和5.53倍。Pin1mRNA的表达与患者的性别、年龄、核分裂象、NIH分级、肿瘤直径大小、肿瘤位置、组织学类型及远处转移均无明显相关性（P＞0.05）；CyclinD1mRNA的表达与NIH分级、肿瘤直径大小有关，与患者的性别、年龄、核分裂象、肿瘤位置、组织学类型及远处转移无明显相关性（P＞0.05）（表4）。

使用双变量相关性分析对GIST组织中Pin1与CyclinD1表达（△CT值）的相关性进行分析，结果显示，Pin1mRNA与CyclinD1mRNA的表达呈正相关（r=0.337，P＜0.05）（图1）。

3 讨论

GIST的发病机制被认为与C-Kit原癌基因及PDGFR基因的突变有关，CD117和CD34的阳性表达为目前诊断GIST的重要指标。近年来分子靶向药物及手术的联合应用明显改善了GIST的治疗效果，但仍然有26%的患者在术后5年内复发［1］，因此对GIST的发病机制及生物学行为的进一步研究十分必要。

Pin1基因是第一个被发现的在酵母和人类细胞的有丝分裂中所必需的肽基脯氨酰顺反异构酶［2］。Pin1蛋白可特异地催化磷酸化后的丝/苏-脯氨酸间肽键发生顺反异构，从而诱导蛋白质构象及功能发生改变。JAMIYANDORJ等［3］通过研究2 041个人类肿瘤样本和609个正常组织的样本发现：Pin1在60种不同肿瘤中的38种中呈高表达，这些肿瘤包含了大部分常见的肿瘤，如前列腺癌、乳腺癌、宫颈癌、肝癌、肺癌等。CyclinD1基因是一种致癌基因，对细胞周期的调控起重要作用。研究［4］表明CyclinD1在多种肿瘤组织中过度表达。有研究［5］发现约51%的GIST患者CyclinD1过表达，且表达水平与预后相关。CyclinD1是Pin1的重要靶基因之一。Pin1可通过多种途径使CyclinD1表达增加，包括通过Ras/Neu-Jun信号转导通路、wnt/β-catenin信号转导通路和NF-κB信号转导通路诱导CyclinD1转录的增加［6-7］，通过直接结合CyclinD1减少其分解，增加CyclinD1的稳定性及其在核内的聚积，从而调节细胞周期［8］。研究［9］发现，肺癌和前列腺癌中，Pin1与 CyclinD1的表达呈正相关。在敲除Pin1基因的小鼠体内CyclinD1呈低表达，其表型与敲除CyclinD1的小鼠相似［10］。

表3 CyclinD1蛋白表达与GIST临床病理参数的关系Tab.3 Relationship between CyclinD1 protein expression and clinicopathological parameters of GIST

本研究结果显示，Pin1与CyclinD1蛋白及mRNA在GIST中过表达，提示Pin1与CyclinD1过表达所导致的细胞增殖异常可能在GIST的发病机制中起重要作用。CyclinD1的表达与GIST的NIH分级及肿瘤大小相关，且随肿瘤恶性程度和肿瘤直径的增加而增强，这与相关文献［5，11］报道符合，提示CyclinD1不仅参与了GIST的发生，可能还与GIST的恶性转变和肿瘤生长相关。Pin1与CyclinD1蛋白及mRNA表达呈正相关，提示Pin1可能通过多种途径调节CyclinD1的表达，二者相互协同，对GIST的发生发展产生影响。

表4 Pin1和CyclinD1 mRNA表达与GIST临床病理参数的关系Tab.4 Relationship between expressions of Pin1 and CyclinD1 mRNA and clinicopathological parameters of GIST

图1 40例GIST患者的CyclinD1△CT与Pin1△CT的散点图Fig.1 Scatter map of CyclinD1△CT and Pin1△CT in 40 patients with GIST

肿瘤的发生发展由多种因素共同作用，本研究结果表明，Pin1及CyclinD1在GIST的发生发展中起重要作用。近年来的大量研究证明，控制Pin1表达及其功能可作为治疗肿瘤的一个新途径，如通过RNA干扰抑制Pin1的表达可以影响前列腺癌细胞的增殖速度，降低其转移能力，并可抑制其致瘤性［12］。CyclinD1表达的检测可能成为预测GIST生物学行为的重要参考指标。

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（编辑 王又冬）

Expression and Clinical Significance of Pin1 and CyclinD1 in Gastrointestinal Stromal Tumor

HUANG Zicheng1，CHEN Qing2，WENG Xiaoyuan2，YANG Zhenrong2，CHEN Huizhong3，ZHOU Yongjian2
（1.Department of Gastroenterology，Quanzhou First Hospital of Fujian Medical University，Quanzhou 362200，China；2.Department of Gastric Surgery，Union Hospital，Fujian Medical University，Fuzhou 350001，China；3.Department of General Surgery，Hui’an Hospital，Hui’an 362100，China）

Objective To investigate the relationship between Pin1 and CyclinD1 expression and the development of gastrointestinal stromal tumor（GIST）.MethodsThe protein and mRNA expression of Pin1 and CyclinD1 in 85 samples of GIST and adjacent non-cancerous tissues were detected by immunohistochemistry and real-time quantitative polymerase chain reaction.ResultsThe expression rate of Pin1 protein in GIST tissues（64.7%；55/85）was higher than that in adjacent non-cancerous tissues（26.7%；4/15）.Similarly，the expression rate of CyclinD1 protein in GIST tissues（42.3%；36/85）was higher than that in adjacent non-cancerous tissues（6.7%；1/15）.The expression ofPin1andCyclinD1mRNA in GIST tissues was 7.03 and 5.53 times that in adjacent non-cancerous tissues，respectively.There was no obvious correlation between the expression of Pin1 and clinicopathological parameters.The expression of CyclinD1 was positively correlated with the grade of NIH and tumor diameter（P＜0.05）.There was a significant correlation between the expression of Pin1 and CyclinD1 in GIST tissues.ConclusionThe expression of both Pin1 and CyclinD1 was up-regulated in GIST tissues.The significant correlation between the expression of Pin1 and CyclinD1 in GIST tissues suggests that their synergistic effect promotes carcinogenesis and the development of GIST.

gastrointestinal stromal tumor；Pin1；CyclinD1；immunohistochemistry；real-time quantitative polymerase chain reaction

R735.2

A

0258-4646（2017）06-0495-06

10.12007/j.issn.0258-4646.2017.06.004

国家自然科学基金（81172380）；福建省卫生系统学术技术带头人后备人基金（010114201）；国家临床重点专科建设基金［卫办医政函（2012）649号］

黄子成（1969-），男，副主任医师，本科.

周永建，E-mail：zyjbju@sina.com

2016-10-25

网络出版时间：