人巨细胞病毒Han株US12基因缺失株的构建及其在人胚肺成纤维细胞中的复制

2017-06-09卢颖马艳萍柳中洋王鸿雁齐莹韩丽英高爽郑博刘畅黄郁晶阮强

中国医科大学学报 2017年6期

卢颖，马艳萍，柳中洋，王鸿雁，齐莹，韩丽英，高爽，郑博，刘畅，黄郁晶，阮强

（1.中国医科大学附属盛京医院病毒研究室，沈阳110004；2.锦州医科大学基础医学院病原生物学教研室，辽宁锦州121000；3.沈阳市妇婴医院临床实验室，沈阳110014；4.沈阳市妇婴医院儿科，沈阳110014）

卢颖1，2，马艳萍1，柳中洋1，王鸿雁1，齐莹1，韩丽英1，高爽3，郑博4，刘畅1，黄郁晶1，阮强1

目的构建人巨细胞病毒（HCMV）Han株US12基因缺失的BAC毒株，研究US12产物对HCMV Han株在人胚肺成纤维细胞（HELF）中复制的影响。方法以侧翼含有US12基因同源序列的PCR引物扩增卡那霉素抗性基因，电转至含有Han株BAC质粒的大肠杆菌DY380-Han-wt-BAC，PCR及DNA测序验证US12缺失的病毒序列。将缺失突变质粒Han-ΔUS12-BAC-P电转至HELF，获得感染性病毒颗粒Han-ΔUS12-BAC。以MOI为0.1的Han-ΔUS12-BAC毒株及Han-wt-BAC毒株感染HELF，TCID50法测定上清中病毒滴度，绘制病毒增殖曲线。结果成功构建了Han-ΔUS12-BAC克隆，转染HELF后成功获得感染性病毒。生长曲线实验结果表明，ΔUS12缺失和野生型毒株在HELF中复制增殖与扩散水平无明显差异。结论US12为HCMV临床株Han在HELF中增殖和扩散过程中的非必需基因。

巨细胞病毒；US12；细菌人工染色体；生长曲线

人巨细胞病毒（human cytomegalovirus，HCMV） US12家族包括US12～US21共10个位置相邻但彼此没有重叠序列的开放读码框架，编码产物与G蛋白耦联受体（G protein-coupled receptors，GPCRs）超家族及抗凋亡蛋白Bax inhibitor 1家族具有结构同源性［1］。该家族成员基因高度保守［2-3］，推测其具有重要的生物学作用，研究［4-10］证实它们参与自然杀伤细胞免疫逃逸，病毒装配成熟与释放，以感染细胞类型特异性的方式调控病毒增殖等。目前关于该家族成员US12生物学功能的研究很少，在HCMV感染人胚肺成纤维细胞（human embryonic lung fibroblast，HELF）复制中发挥的作用也仅限于AD169［9］与Towne［11］等实验室株，而US12是否影响HCMV临床株感染HELF后的复制与扩散未见报道。

本研究室在2013年已成功构建HCMV临床株Han全基因组BAC克隆［12］并转入大肠杆菌溶原菌株DY380［13］。为探讨US12编码产物在HCMV感染HELF过程中对病毒复制的影响，本研究利用DY380 λ缺陷噬菌体Red重组酶的同源重组特性，构建Han-ΔUS12-BAC病毒株，并初步观察了Han-ΔUS12-BAC株与Han-wt-BAC株在HELF中的复制与扩散水平。

1 材料与方法

1.1 材料

BAC体系相关实验材料（BAC质粒、E.coli DH10B、E.coliDY380、pGEM-oriV/Kan等）由美国新泽西医科大学微生物与分子生物学系副研究员朱桦博士惠赠［13-14］。HCMV Han-wt-BAC克隆与病毒株为中科院武汉病毒所罗敏华教授课题组与中国医科大学附属盛京医院病毒研究室共同构建［12］，BAC毒株以绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）表达为病毒增殖指标。HELF由中国科学院武汉病毒学研究所罗敏华教授惠赠。

Nucleobond Xtra Midi DNA purification kit购自德国Macherey-Nagel公司；MEM、高糖DMEM培养基、胎牛血清、胰蛋白酶等购自美国HyClone公司；DpnⅠ酶购自日本TaKaRa公司；Wizard®SV Gel and PCR Clean-Up System及Wizard®Plus SV Minipreps DNA Purification System购自美国Promega公司。

采用primer premier 5.0软件设计US12缺失构建及鉴定引物序列（表1，图1）。

1.2 方法

1.2.1 感受态E.coliDY380-Han-wt-BAC的制备：取E.coliDY380-Han-wt-BAC甘油保存菌，接种于含氯霉素LB培养基中，32℃过夜振荡培养。以1∶100比例将菌液加入新的氯霉素抗性LB培养基中，继续培养2～4 h，至OD600达到0.5～0.6。42℃水浴振摇15 min，立即转移菌液到冰水混合物中，冰浴30 min。转移菌液至预冷的离心瓶中，5 000g、4℃离心5 min。使用预冷的10%甘油洗涤沉淀，5 000g、4℃离心5 min，重复洗涤4次，使用1 mL 10%甘油重悬沉淀，分装100 μL/支，-80℃保存。

表1 US12缺失构建及鉴定引物序列Tab.1 Primers for US12 deletion construction and identification

图1 实验所用引物在US11-US13位点的位置Fig.1 Positions of primers in the US11-US13 locus

1.2.2 US12特异性Kan抗性基因片段的制备：以质粒pGEM-oriV/Kan为模板，使用ΔUS12-kan-F和ΔUS12-kan-R引物扩增卡那霉素抗性基因片段。反应体系：ddH2O 27 μL，10×LA Taq buffer 5 μL，dNTP 8 μL，MgCl25 μL，ΔUS12-kan-F 1 μL，ΔUS12-kan-R 1 μL，LA Taq 1 μL，pGEM-oriV/Kan 2 μL，总反应体系50 μL。扩增条件：98℃5 min；94℃30 s，55℃30 s，72℃2.5 min，30个循环；72℃10 min。DpnⅠ酶消化PCR产物以去除残留模板质粒。同时，设1组不加LA Taq的阴性对照组，其他成分及反应条件同PCR扩增组。使用Wizard®SV Gel and PCR Clean-Up System Promega试剂盒从DpnⅠ酶切处理后的PCR扩增产物中切胶纯化卡那霉素抗性片段。

1.2.3 Kan抗性片段电转感受态E.coliDY380-Hanwt-BAC［15］：取5 μL纯化的PCR产物与100 μL DY380-Han-wt-BAC感受态菌混匀，转移到1 mm预冷的电转杯中。同时电转等体积的阴性对照组纯化的PCR产物。应用BioRad电转仪进行电击转化，参数设定为1.75 kV，25 μF，200 Ω，电击时间为5 ms。电转后，立即加入1 mL的预先平衡至室温的LB培养基，转移到1.5 mL的EP管，32℃，225 r/min，培养1 h。4 000 r/min离心5 min，弃上清，加入200 μL LB培养基重悬，吹打混匀，涂布于卡那霉素与氯霉素抗性LB平板，32℃培养24～48 h。

1.2.4 Han-ΔUS12-BAC-P质粒的PCR及测序鉴定：挑选单克隆菌，应用ΔUS12 R1和ΔUS12 F1引物进行菌落的PCR鉴定。挑取PCR鉴定为阳性的菌落接种于含有卡那霉素和氯霉素的LB液体培养基进行扩增培养。采用Macherey-Nagel公司Nucleobond试剂盒，参考Plasmid DNA Purification User manual Nucleobond Xtra Midi步骤纯化Han-ΔUS12-BAC-P质粒。应用引物ΔUS12F1/ΔUS12R1与ΔUS12F2/ ΔUS12R2 PCR鉴定纯化的质粒，并采用引物ΔUS12F1/ΔUS12R1进行重组质粒的DNA测序鉴定。

1.2.5 Han-ΔUS12-BAC毒株的获得：取Han-ΔUS12-BAC-P质粒5 μg、pp71质粒［15］1 μg与HELF悬液混合于预冷的4 mm电转杯中，电转化条件为电压150 V，电容975 μF，电阻∞，电击时间约为30～50 ms。电转后，向电转杯中加入MEM生长液1 mL，混匀，转移至T25 cm2培养瓶中，补足培养液，常规培养。直至出现GFP表达及HCMV特异性细胞病变效应（cytopathic effect，CPE）。待CPE达到100%后，收集Han-ΔUS12-BAC毒株，冻存备用。

1.2.6 Han-ΔUS12-BAC病毒及Han-wt-BAC病毒滴度（TCID50）测定：按照2×104/孔将HELF接种于96孔板，培养至形成均匀致密细胞单层。用MEM维持液分别10倍稀释Han-ΔUS12-BAC病毒及Han-wt-BAC毒株，稀释度为10-1～10-6。弃96孔板中培养液，由高稀释度到低稀释度的顺序依次加入病毒悬液，每孔100 μL，每个病毒样本每一稀释度加入12孔，同时设正常细胞对照孔。在每次检测中，同时进行完全相同的2块培养板操作。37℃、5%CO2培养2周。接种病毒后7～14 d荧光显微镜下观察，计数每个稀释度12个接种病毒孔中GFP阳性孔数量，按Reed-Muench两氏法计算病毒滴度。

1.2.7 Han-ΔUS12-BAC病毒及Han-wt-BAC病毒在HELF中增殖：按照感染复数（multiplicity of infection，MOI）为0.1将Han-ΔUS12-BAC病毒及Han-wt-BAC病毒分别接种于HELF，在接种后0、2、4、6、8、10、12 d收集培养物上清，采用TCID50法检测其中病毒滴度。接种病毒后2 h为0 d时间点。以3次独立的重复实验结果（x±s）绘制生长曲线。

1.2.8 US12蛋白功能位点预测：应用Genedoc结合在线功能位点预测软件ScanProsite，对US12蛋白功能位点进行预测。

2 结果

2.1 US12特异性Kan抗性基因片段的制备

应用ΔUS12-kan-F和ΔUS12-kan-R引物，以pGEM-oriV/Kan质粒为模板PCR扩增卡那霉素抗性基因，检测到约2 050 bp的扩增条带（图2）。

2.2 Han-ΔUS12-BAC-P质粒的PCR及测序鉴定

将US12特异性Kan抗性基因片段电转至DY380-Han-wt-BAC感受态菌，涂于卡那霉素与氯霉素抗性LB培养板后24～48 h，见若干菌落出现，而在不加LA-Taq进行扩增的阴性对照平板中未见菌落生长。

图2 US12特异性Kan抗性基因片段的PCR扩增结果Fig.2 PCR amplification of US12-specific Kan-resistant gene

将PCR鉴定为阳性的克隆菌落扩增培养，纯化Han-ΔUS12-BAC-P质粒。采用ΔUS12F1与ΔUS12R1引物PCR鉴定，结果见1条约2 050 bp的单一扩增带，ΔUS12F2与ΔUS12R2引物鉴定未见扩增条带，US13F与US13R引物鉴定见扩增条带，与预期结果一致（图3）。应用ΔUS12F1/US12R1对纯化质粒Han-ΔUS12-BAC-P进行测序鉴定，测序结果与预期结果一致，表明Han-ΔUS12-BAC-P质粒中US12基因被Kan抗性基因替换，而临近基因未受影响。

图3 Han-ΔUS12-BAC-P纯化质粒的PCR鉴定结果Fig.3 PCR identification of Han-ΔUS12-BAC-plasmid

2.3 Han-ΔUS12-BAC病毒的获得

将Han-ΔUS12-BAC-P质粒分别电转至HELF。培养约10～14 d后在普通倒置显微镜下可见HCMV典型CPE出现（图4A、4C）；荧光显微镜观察到病毒特异性GFP表达（图4B、4D）。

2.4 Han-ΔUS12-BAC毒株生长曲线实验

图4 Han-ΔUS12-BAC-P电转HELF 10 d及14 d后产生的病变效应及荧光结果Fig.4 Cytopathic effect and GFP expression in HELF after 10 and 14 days of electroporation with Han-ΔUS12-BAC-P

以MOI为0.1的Han-ΔUS12-BAC病毒和Han-wt-BAC病毒分别感染HELF，采用TCID50法检测接种后0、2、4、6、8、10、12 d培养物上清中的病毒滴度绘制生长曲线。结果（图5）显示，在感染后的第4、6天Han-ΔUS12-BAC病毒效价略高于Han-wt-BAC病毒，而在8 d后两者趋于相同。说明在HCMV临床株Han感染HELF细胞过程中，US12基因对于病毒复制与扩散并非必不可少。

2.5 HCMV Han US12蛋白功能位点预测

应用Genedoc与ScanProsite对HCMV Han株 US12蛋白功能位点进行预测，结果表明，US12编码产物预计有4个磷酸化位点，分别是位于31～34的cAMP与cGMP依赖的蛋白激酶磷酸化位点，位于37～40和232～235的酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点，以及位于42～44的蛋白激酶C磷酸化位点（图6）。

3 讨论

图5 Han-ΔUS12-BAC与Han-wt-BAC毒株在HELF中的生长曲线（以3次独立的重复实验结果x±s绘制）Fig.5 Growth kinetics of Han-ΔUS12-BAC and Han-wt-BAC strains in HELF（values of the viral titer represent the average obtained from triplicate experiments）

图6 HCMV Han US12蛋白功能位点预测Fig.6 Functional motifs prediction of HCMV Han US12

HCMV基因组约240 kb，病毒复制周期较长，部分成熟病毒颗粒滞留于感染细胞内。对HCMV进行基因定点突变，传统的RecA介导同源重组方法操作繁琐耗时，效率低下，目前已逐渐被λ Red同源重组工程体系所代替。λ前噬菌体缺失部分为导致裂解性感染的cro至bioA基因区。PL启动子调控的同源重组酶基因exo，beta，gam的表达受到温度敏感λ抑制子（cI857）的严格控制。cI857在42℃下失活，使exo，beta，gam基因表达，可避免电转至细胞内的线性双链DNA被RecBCD降解，并具有同源重组活性。相比基于Red质粒的重组体系，具有表达稳定、重组效率高的优势［16］。

BAC在克隆HCMV等长基因组病毒方面有明显优势，不仅转化效率高，且易于纯化，也保障了病毒基因组序列在不断增殖过程中保持稳定［17］。本研究利用已经成功构建的Han-wt-BAC克隆［12］，成功获得了US12缺失突变BAC病毒株。在进行突变株病毒拯救之前，对US12缺失BAC克隆进行测序确认。电转化HELF 10～14 d后出现细胞病变效应及GFP表达，说明US12表达产物缺失并未影响病毒成熟与包装。

HCMVUS12基因家族为保守基因区，是七次跨膜蛋白超家族的一个独立分支家族。该家族仅在灵长类巨细胞病毒中存在，说明该家族成员为新近进化基因区。尽管HCMVUS12基因家族成员的结构和序列与GPCR家族成员具有一定程度的同源性，迄今尚未确定US12家族成员与HCMV编码的GPCR成员如US27、US28、UL33和UL78等，具有相同的功能。作为US12家族成员之一的US12基因，相关研究结果仅在关于HCMV转录组和蛋白质组功能高通量分析中涉及。为了鉴定与HCMV潜伏感染建立相关的基因，CHEUNG等［18］在HCMV TownevarRIT3株感染原代人粒—巨噬细胞祖细胞后1～11 d检测到37种病毒RNA，其中US12mRNA在潜伏感染建立的第1天表达，说明US12可能参与潜伏感染的建立。尽管HCMVUS12缺失对Towne株在HELF中复制并无影响［11］，但是HCMV低传代临床分离株US12基因在感染HELF及内皮细胞、上皮细胞等其他容许宿主细胞中对于病毒复制及感染扩散的作用至今并无报道。

本研究中，低剂量Han-ΔUS12-BAC与Han-wt-BAC毒株感染HELF生长曲线结果表明，尽管Han-ΔUS12-BAC株在第4、6天的滴度略高于Han-wt-BAC，但8 d后2种病毒滴度趋于一致，Han-ΔUS12-BAC与Han-wt-BAC 2株病毒在HELF中复制扩散无明显差异，表明US12对HCMV临床分离株Han在HELF中的复制及病毒播散并非必不可少。US12基因在HCMV感染内皮细胞及上皮细胞等其他细胞类型中对病毒复制的影响需要进一步研究。

目前，关于US12家族成员的研究，除了该家族基因区转录本结构的研究［19-20］和其编码蛋白对病毒复制的影响以外，其表达产物在感染细胞中的定位也是研究热点之一。DAS等［6-7］对US14，US17和US18表达蛋白在HELF内的定位进行了研究，发现它们分布于感染细胞胞质中高尔基体反面网状结构、内体溶酶体及病毒装配复合体（virion assembly complex，vAC）的内部或周边。这些病毒蛋白在细胞内的定位和分布具有感染时相依赖性。不同于该家族其它成员蛋白的定位特点，US17不仅分布于胞质，还以病毒感染依赖的方式分布于细胞核的内部。已证实存在于胞核内的并非US17完整蛋白，而是其可溶性的羧基端片段［7］。BRONZINI等［8］利用BAC克隆构建了US16 HA标记的重组HCMV病毒，在感染晚期阶段检测到US16聚集于胞质中病毒装配复合体。下一步US12编码产物在HELF中定位的研究工作可为探索其功能提供线索。

基于生物信息学分析进行的US12蛋白功能预测也可为今后的研究提供方向。据报道，US12在第七跨膜区TM7与羧基端之间存在（S/T）xxx（W/F）基序［1］，这一基序与Wnt［21］受体Frizzled家族中的KTxxxW基序为同源序列，而该序列正是Frizzled受体与胞内磷酸化蛋白Dishevelled相互作用的区域。位于US12第二胞浆环C2区的DYT基序同经典GPCR与G蛋白结合的DRY基序相似，US12也可能参与GPCR介导的信号调节。结合本研究得到的US12编码蛋白氨基端和羧基端存在磷酸化位点的预测结果，如US12蛋白确能与Dishevelled或G蛋白结合而参与Wnt等信号通路的调节，则预示着其可能在HCMV致病过程中发挥重要作用。关于US12相互作用蛋白的实验研究对揭示其功能具有重要意义，有待进一步深入探讨。

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（编辑王又冬）

Construction of Human Cytomegalovirus Han-ΔUS12-BAC Strain and Studies on Its Replication in Human Embryonic Lung Fibroblasts

LU Ying1，2，MA Yanping1，LIU Zhongyang1，WANG Hongyan1，QI Ying1，HAN Liying1，GAO Shuang3，ZHENG Bo4，LIU Chang1，HUANG Yujing1，RUAN Qiang1

（1.Virus Laboratory，Shengjing Hospital，China Medical University，Shenyang 110004，China；2.Department of Pathogen Biology，College of Basic Medical Sciences，Jinzhou Medical University，Jinzhou 121000，China；3.The Clinical Laboratory，Shenyang Women’s and Children’s Hospital，Shenyang 110014，China；4.The Pediatric Department，Shenyang Women’s and Children’s Hospital，Shenyang 110014，China）

Objective To construct human cytomegalovirus（HCMV）Han-ΔUS12-BAC strain and to study the role of US12 in HCMV replication in human embryonic lung fibroblasts（HELF）.MethodsKanamycin-resistant gene was amplified with primers containing homology arms sequence flankingUS12and then electroporated intoE.coliDY380-Han-wt-BAC competent cells.Successfully recombinant Han-ΔUS12-BAC clones were identified by PCR，sequenced for confirmation Han-ΔUS12-BAC plasmids were electroporated into HELF to produce infectious virions.Han-ΔUS12-BAC and Han-wt-BAC were inoculated onto HELF at the multiplicity of infection of 0.1 pfu/cell.The viral titer in the supernatant was measured by TCID50 assay and growth kinetics of the viruses in HELF was studied.ResultsHan-ΔUS12-BAC clone was successfully constructed.Han-ΔUS12-BAC was reconstructed in HELF to generate infectious virions.Growth kinetics assay indicated that Han-ΔUS12-BAC and Han-wt-BAC showed no differences in their growth and dissemination in HELF.ConclusionUS12in HCMV clinical strain Han is dispensable for HCMV growth and dissemination in HELF.

cytomegalovirus；US12；bacterial artificial chromosome；growth kinetics

R373.9

0258-4646（2017）06-0489-07

10.12007/j.issn.0258-4646.2017.06.003

国家自然科学基金（30672248，81371788）；盛京医院自由研究者项目

卢颖（1971-），女，副教授，博士.

阮强，E-mail：ruanq@sj-hospital.org

2016-09-13

网络出版时间：