余甘根苷B对柯萨奇病毒B3感染的心肌细胞及Balb/c小鼠的保护作用*

王鹏举，彭有梅，张 艳，江金花，范程程，娄晓月，陈文娟，王亚峰#

1)郑州大学基础医学院中英分子肿瘤学研究中心 郑州 450052 2)河南省(郑州大学)医药科学研究院河南省肝病药理重点实验室 郑州 450052 3)郑州大学药学院临床药理学系 郑州 450001

余甘根苷B对柯萨奇病毒B3感染的心肌细胞及Balb/c小鼠的保护作用*

王鹏举1)，彭有梅2)，张 艳2)，江金花2)，范程程3)，娄晓月3)，陈文娟3)，王亚峰3)#

1)郑州大学基础医学院中英分子肿瘤学研究中心 郑州 450052 2)河南省(郑州大学)医药科学研究院河南省肝病药理重点实验室 郑州 450052 3)郑州大学药学院临床药理学系 郑州 450001

#通信作者，女，1980年5月生，博士，讲师，研究方向：抗病毒药理，E-mail:yfwang@zzu.edu.cn

余甘根苷B；柯萨奇病毒B3；心肌细胞

目的：探讨余甘根苷B对柯萨奇病毒B3(CVB3)感染的心肌细胞及Balb/c小鼠的保护作用。方法：首先构建CVB3感染的心肌细胞模型和动物模型，观察心肌细胞的病变效应，检测心肌细胞上清液中天冬氨酸氨基转移酶(AST)和乳酸脱氢酶(LDH)释放量的变化，并通过电子显微镜观察小鼠心肌组织的超微结构变化，检测余甘根苷B对心肌细胞的保护作用。结果：在CVB3感染的心肌细胞模型中，CVB3感染可引起细胞发生碎裂、脱落等细胞病变现象，余甘根苷B作用后，可以显著减轻细胞病变，同时能明显抑制细胞释放的心肌酶AST和LDH的活性(P<0.05)；在CVB3感染的小鼠模型中，小鼠心肌组织超微结构的结果显示，CVB3感染能引起心肌纤维断裂溶解、细胞核结构破坏等病理损伤，余甘根苷B 则能减轻CVB3感染造成的心肌组织的损伤。结论：余甘根苷B对CVB3感染的心肌细胞和Balb/c小鼠具有明显的保护作用。

病毒性心肌炎(viral myocarditis，VMC)是由病毒感染所引起的一类非缺血性心脏病，引起VMC的病毒种类很多，但大部分VMC是由柯萨奇病毒B3(coxsackie virus B3，CVB3)感染引起[1]，严重者可发展为扩张性心肌病、心力衰竭，甚至猝死，目前临床上尚缺乏安全有效的抗CVB3药物。余甘根苷B是从余甘子根中提取分离出的一个全新的倍半萜类化合物[2]，在前期研究[3]中已初步证明余甘根苷B具有很好的抗CVB3活性。该研究通过观察余甘根苷B对心肌的保护作用，确定余甘根苷B的抗病毒活性，为进一步的深入研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验药物和试剂 余甘根苷B(中国科学院昆明植物研究所提供)，纯度在98.5%以上，实验时溶于一定量DMSO配制成母液，使用时用DMEM培养液稀释。DMEM培养基购自HyClone公司，病毒唑购自河南润弘制药股份有限公司，天冬氨酸氨基转移酶(AST)测试盒和乳酸脱氢酶(LDH)测试盒购自南京建成生物工程研究所。

1.2 实验用细胞、病毒和动物 HeLa细胞株和CVB3(Nancy株)病毒由暨南大学王一飞教授惠赠；原代培养的大鼠心肌细胞[来自新生1～3 d的SD大鼠乳鼠心脏，通过胰蛋白酶消化分离法分离得到。SPF级新生1～3 d的SD大鼠乳鼠，由河南省实验动物中心提供，许可证号为：SCXK(豫)2015-0004]；SPF级雄性Balb/c小鼠，6～8周龄，体重18～22 g，购自湖南斯莱克景达试验动物有限公司，许可证号：SCXK(湘)2011-0003。

1.3 余甘根苷B对CVB3感染的心肌细胞的保护作用

1.3.1 乳鼠原代心肌细胞的制备[4]将新生1～3 d SD大鼠乳鼠的心脏取出，心尖部剪成约1 mm3大小的组织碎块。加入1 g/L的胰蛋白酶溶液消化(共消化7次)，收集后5次消化液中的细胞放置到培养瓶中。由于成纤维细胞贴壁速度比心肌细胞快，贴壁培养1 h后大部分成纤维细胞已经贴壁，而心肌细胞仍分布在上清悬液中，随后将上清悬液吸出并调整细胞浓度为1.0×105mL-1，将得到的心肌细胞加到培养板中，置于37 ℃、体积分数5%CO2培养箱中继续培养，长成单层并且细胞密度达到70%时用于实验。

1.3.2 余甘根苷B对原代培养心肌细胞毒性的检测 将系列稀释的余甘根苷B分组加入到已长成单层的原代心肌细胞中，同时设病毒唑阳性药对照(病毒唑对照组)和未加药的正常对照组，将培养板于37 ℃、体积分数5%CO2培养箱中培养48 h，观察细胞的生长状态，确定实验样品无毒浓度范围(使细胞不发生明显毒性反应的浓度范围)，即最大无毒浓度TC0。

1.3.3 余甘根苷B体外抗CVB3活性实验 分离出的心肌细胞重悬后接种于96孔板中，将培养板置于37 ℃、体积分数5%CO2培养箱中培养24 h，随后将余甘根苷B和CVB3稀释液各50 μL分组加入板中，同时另设正常对照组、病毒对照组和病毒唑对照组(每组设3个复孔)。每日观察细胞病变情况，待病毒对照组75%以上的细胞发生病变，而正常对照组细胞形态完全正常时作为检测点结束培养，将各组的细胞上清液收集，检测上清液中天冬氨酸氨基转移酶(AST)和乳酸脱氢酶(LDH)的活性。

1.4 余甘根苷B对CVB3感染的小鼠心肌的保护作用

1.4.1 动物模型的建立及治疗 采用随机数字表法将雄性Balb/c小鼠分为6组(每组各10只)：正常对照组、病毒对照组、余甘根苷B高剂量组[12 mg/(kg·d)]、余甘根苷B中剂量组[8 mg/(kg·d)]、余甘根苷B低剂量组[4 mg/(kg·d)]和病毒唑对照组[125 mg/(kg·d)]。除正常对照组外，其余各组小鼠均腹腔注射100 TCID50CVB3病毒液，建立VMC小鼠模型。在小鼠接种病毒24 h后开始给药，采取小鼠尾静脉注射给药的方式，给药量为每只小鼠0.2 mL/10 g，而正常对照组和病毒对照组小鼠每日给予等体积生理盐水。所有实验动物给药1次/d，连续处理7 d，于感染后第8天断颈处死动物。

1.4.2 余甘根苷B作用后VMC小鼠心肌电镜病理组织学检测 在连续用药7 d后，即感染后第8天，断颈处死实验动物，从心脏取1 mm3的组织块， 体积分数2.5%戊二醛和10 g/L锇酸双重固定，经过一系列处理后，将处理好的切片置透射电镜下观察心肌组织超微结构的变化。

1.5 统计学处理 采用SPSS 13.0进行分析。应用单因素方差分析和SNK-q检验比较各组心肌酶释放量的不同，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 余甘根苷B对CVB3感染的心肌细胞的保护作用

2.1.1 余甘根苷B的对原代培养的心肌细胞毒性测定 系列稀释的余甘根苷B作用心肌细胞48 h后，正常对照组细胞生长良好，细胞形态正常，比较透明；高浓度余甘根苷B对细胞的毒性较大，表现出明显的毒性反应：细胞形态发生改变(固缩或破碎)，细胞吸光度下降，出现脱落、死亡；随着余甘根苷B浓度的降低，对细胞的毒性反应逐渐减轻，在余甘根苷B无毒浓度时，实验组细胞与正常对照组细胞在形态和数量上没有差别。经检测得到余甘根苷B及病毒唑对原代培养的SD大鼠乳鼠心肌细胞的TC0分别为25 mg/L和250 mg/L。

2.1.2 余甘根苷B 对CVB3感染原代心肌细胞的保护作用 CVB3感染SD大鼠乳鼠原代培养心肌细胞后，可使细胞搏动逐渐减慢甚至停止搏动，细胞形态发生明显改变，呈现典型的细胞变圆、团缩、碎裂、脱落等细胞病变现象。余甘根苷B作用后，CVB3感染导致的心肌细胞的病变程度明显减轻，结果见图1。

A：正常对照组；B：病毒对照组；C：余甘根苷B组；D：病毒唑对照组。图1 余甘根苷B对CVB3感染心肌细胞的保护作用(×100)

2.1.3 余甘根苷B对CVB3感染心肌细胞心肌酶释放量的影响 余甘根苷B作用后，与病毒对照组相比，余甘根苷B组的上清液中AST和LDH的表达量明显降低，结果见表1。说明余甘根苷B作用后，可以抑制CVB3感染引起的心肌细胞酶的释放，使CVB3感染造成的心肌细胞损伤程度降低，对VMC起到很好的治疗作用。

表1 各实验组心肌酶释放量的检测(n=3) IU/L

*：与病毒对照组比较，P<0.05。

2.2 余甘根苷B对CVB3感染的小鼠心肌组织超微结构改变 通过对小鼠心肌组织透射电镜结果(图2、3)观察发现，正常对照组小鼠心肌细胞超微结构无明显改变，肌纤维完整，彼此平行排列，明暗带周围结构清晰，细胞内线粒体结构完整，细胞核核膜完整，核内染色质均匀分布。病毒对照组在CVB3作用下，小鼠心肌细胞肌丝溶解断裂，肌纤维破坏，排列紊乱，明暗带模糊甚至消失，线粒体结构不完整，细胞核核膜结构破坏，核染色质浓缩，集中分布在核膜周边。与病毒对照组相比，余甘根苷B高、中剂量组中由CVB3感染造成的心肌损伤明显减轻，肌纤维连贯，明暗带清晰，线粒体结构完整，细胞核结构完整，染色质分布均匀。

A：正常对照组；B：病毒对照组；C：病毒唑对照组；D：余甘根苷B高剂量组；E：余甘根苷B中剂量组；F：余甘根苷B低剂量组。图2 各组小鼠心肌超微结构变化(×10 000)

A：正常对照组；B：病毒对照组；C：病毒唑对照组；D：余甘根苷B高剂量组；E：余甘根苷B中剂量组；F：余甘根苷B低剂量组。图3 各组小鼠心肌细胞核超微结构变化(×20 000)

3 讨论

临床上大多数VMC是由CVB3感染所致，初期症状不明显，多表现为病毒感染所引起的一般症状，不具有特异性，常见的如发热、胸痛、全身倦怠、酸痛等，常常不引起患者的注意，从而使一部分患者发展为扩张性心肌病[5-6]，而扩张型心肌病5 a生存率约为50%左右，后期会发展为心力衰竭、心源性休克，甚至猝死。对它的研究及药物研发越来越显示出其重要的地位。

近年来，在治疗VMC方面取得了一些进展[7-10]。余甘子是中国的传统中药材，其根、叶、果都具有重要的药用价值，已发现余甘子具有抗菌[11]、抗肿瘤[12]、抗氧化[13]等活性。

在VMC的发病早期，临床上由于缺乏特异性的诊断标准，一般采用检测心肌酶的表达水平来间接检测心肌细胞的损伤程度，LDH和AST是诊断VMC的标志性心肌酶[14]。该研究中，作者检测了CVB3感染的乳鼠心肌细胞上清液中的心肌酶水平，发现CVB3感染后，与正常对照组相比，心肌细胞出现明显的细胞病变，上清液中LDH和AST表达水平明显升高，在余甘根苷B作用后，与病毒对照组相比，心肌细胞的细胞病变明显减轻，上清液中心肌酶的活性明显降低，差异有统计学意义，说明余甘根苷B可以减轻CVB3感染所造成的心肌细胞损伤，维持心肌细胞的正常功能，对心肌细胞有较好的保护作用。

在CVB3感染的Balb/c小鼠模型中，对小鼠心肌组织的超微结构进行了进一步的观察，发现CVB3感染后，和正常对照组相比，小鼠心肌组织的超微结构发生了明显的损伤性改变。表现为心肌细胞正常结构被破坏，具体可表现为肌丝溶解、断裂，肌原纤维明暗带正常结构消失，线粒体损伤，细胞核表现为核膜结构破坏，染色质凝集。而余甘根苷B 作用后，高、中剂量组中CVB3感染造成的心肌组织超微结构损伤明显减轻，心肌肌纤维结构恢复正常，排列整齐，明暗带清晰，细胞核核膜完整，染色质分布均匀；低剂量组余甘根苷B作用后没有明显改善CVB3感染造成的心肌损伤。

综上所述，余甘根苷B在体外和体内均可以明显抑制CVB3的感染，减轻CVB3感染造成的心肌损伤，维持心肌组织的正常功能，从而起到治疗VMC的作用，且治疗作用与阳性药物病毒唑相似，为治疗VMC提供了一个很好的候选药物。

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(2016-12-29收稿 责任编辑赵秋民)

Protection effect of phyllaemblicin B on coxsackie virus B3 infected myocardiocytes and Balb/c mice

WANGPengju1),PENGYoumei2),ZHANGYan2),JIANGJinhua2),FANChengcheng3),LOUXiaoyue3),CHENWenjuan3),WANGYafeng3)

1)Sino-BritishResearchCentreforMolecularOncology,SchoolofBasicMedicalSciences,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052 2)HenanKeyLaboratoryforPharmacologyofLiverDiseases,HenanAcademyofMedicalandPharmaceuticalSciences,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052 3)DepartmentofClinicalpharmacology,SchoolofPharmaceuticalSciences,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450001

phyllaemblicin B；coxsackie virus B3；myocardiocyte

Aim: To investigate the protection effect of phyllaemblicin B on myocardiocytes and Balb/c mice infected with coxsackie virus B3(CVB3).Methods: Viral myocarditis(VMC) models infected with CVB3 were established in myocardiocytes and Balb/c mice. Cell survival rate was measured by cytopathic effect(CPE) assay, the contents of aspartate transferase(AST) and lactate dehydrogenase(LDH) were determined in supernatant of myocardiocytes culture medium. Histopathological changes of myocardium of Balb/c mice infected with CVB3 were analyzed to test the antiviral activity of phyllaemblicin B. Results: CVB3 infection induced obvious CPE in myocardiocytesinvitro. After treatment with phyllaemblicin B, CPE on myocardiocytes infected with CVB3 was obviously inhibited, meanwhile the activities of AST and LDH were dramatically reduced compare with the untreatment group(P<0.05). Ultra-structure of mouse myocardium demonstrated that CVB3 infection led to pathological lesions including cardiac muscle fibers breakdown and destruction of nucleus structure. With the treatment of phyllaemblicin B, the histopathology changes in mice myocardium were alleviated.Conclusion: Phyllaemblicin B has obvious protection effect on myocardiocytes and Balb/c mice infected with CVB3.

10.13705/j.issn.1671-6825.2017.03.006

*国家自然科学基金青年科学基金项目 81302813

R285.5